【目的】CHARGE综合征是一种罕见且临床表型极为复杂的先天性异常综合征,发病率约为1/8,500-1/15,000,致病机制尚不清楚且无有效的治愈方法,临床上仅能给予对症治疗。本研究的主要目标是针对一个CHARGE综合征家系进行致病基因筛查,明确其致病基因,并探索突变对相关致病基因蛋白结构和功能的影响,以明确其致病机制,为临床上CHARGE综合征的产前筛查、诊断及研发可靠的治疗药物提供关键性依据。【方法】(1)收集一CHARGE综合征家系,依据CHARGE综合征的临床诊断标准及诊治指南,确诊为CHARGE综合征,绘制家系图谱,在获得每位受试者的知情同意后,收集患者及家属的临SAG半抑制浓度床资料并抽取外周血。(2)经全外显子组测序,基于变异有害性、隐性遗传及新生突变等方式筛选致病基因,通过显著性富集分析确hepatic cirrhosis定突变致病基因参与的最为重要的生化代谢途径及信号转导途径,Sanger测序验证候选致病基因突变位点。(3)通过蛋白水平分析研究候选致病基因突变蛋白的理化性质、疏水性质、亚细胞定位、信号肽、跨膜螺旋结构以及蛋白二级结构及其与野生型的差异。(4)构建候选致病基因所在的核心区域蛋白三维模型,并利用所建蛋白三维结构模型进行候选致病基因突变蛋白三维结构建模,分析突变对蛋白结构功能的影响。(5)依据蛋白-蛋白互作预测结果,进行蛋白-蛋白对接,比较突变前后蛋白-蛋白相互作用的变化及影响,推测在CHARGE综合征发病过程中的致病机制。【结果】(1)本研究筛选出4个致病基因CUBN(c.1952G>C)、AMOT(c.1412G>A)、TRPM4(c.1169A>T)及CHD7(c.3089A>G),然后进行 Sanger验证。(2)致病基因突变蛋白的蛋白理化性质发生不同程度的改变。(3)CUBN(Arg651Pro)、AMOT(Arg471His)、TRPM4(Lys390Met)和CHD7(Asn1030Ser)突变蛋白疏水性升高,其中以TRPM4(Lys390Met)升高最为显著。(4)TRPM4(Lys390Met)突变引起其8个跨膜螺旋结构区中的5个发跨膜螺旋结构区发生改变。(5)CUBN(Arg651Pro)、AMOT(Arg471His)、TRPM4(Lys390Met)和CHD7(Asn1030Ser)突变蛋白对蛋白二级结构造成了不同程度的影响。(6)致病基因突变位点使蛋白的三维构象发生显著变化。(7)突变位点致CUBN-AMOT、CHD7-AMOT、CUBN-AMOTCHD7蛋白之间相互作用发生变化。【结论】(1)经全外显子组测序筛选出候选基因致病位点为CUBN(c.1952G>C)、AMOT(c.1412G>A)、TRPM4(c.1169A>T)以及CHD7(c.3089A>G)基因错义突变。(2)通过蛋白理化性质分析表明Arg651Pro、Arg471His、Lys390Met以及Asn1030Ser突变蛋白理化性质发生不同程度的变化。(3)经过蛋白疏水性分析发现CUBN(Arg651Pro)、AMOT(Arg471His)、TRPM4(Lys390Met)和CHD7(Asn1030Ser)突变蛋白疏水性升高,其中以TRPM4(Lys390Metselleck化学)升高最为明显。疏水性变化可能对蛋白三维结构产生影响。(4)跨膜结构分析软件表明TRPM4(Lys390Met)突变引起其8个跨膜螺旋结构区中的5个发跨膜螺旋结构区发生构象变化。考虑是由于突变蛋白疏水性质的改变而导致跨膜螺旋区位置的改变。(5)经蛋白二级结构预测发现CUBN(Arg651Pro)、AMOT(Arg471His)、TRPM4(Lys390Met)和CHD7(Asn1030Ser)突变蛋白使其二级结构发生了改变。(6)利用同源建模软件成功构建野生型及突变型CUBN、AMOT、TRPM4及CHD7蛋白三维模型,经过各自野生型与突变型蛋白三维结构叠加对比分析,发现CUBN及CHD7突变蛋白存在重要结构域的变化,AMOT、TRPM4及CHD7突变蛋白也导致了蛋白三维结构的显著变化。(7)蛋白-蛋白相互作用分析表明,CUBN-AMOT、CHD7-AMOT、CUBN-AMOT-CHD7蛋白之间可以互相作用,并且突变后的蛋白互作接触面积、疏水相互作用、氢键、盐桥及阳离子-π相互作用均发生了巨大变化,结果提示以上突变蛋白相互作用模式极大可能是CHARGE综合征致病的关键机制之一。