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角蛋白酶(Keratinase)是一类可以特异性降解角蛋白的酶。在废弃物回收、皮革纺织和饲料添加等领域有着广泛的应用前景。然而,较低的胞外genetic enhancer elements表达量仍是重组角蛋白酶开发的主要问题。因此,如何提高重组角蛋白酶的胞外表达量成Erastin采购为目前研究热点之一。本文以重组枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis WB600-p43NMK-Ker为研究对象,通过信号肽的筛选与理性设计、核糖体结合位点半理性设计、枯草芽孢杆菌分泌系统改造,提高了角蛋白酶的胞外表达量。主要研究内容如下:(1MLN8237抑制剂)基于信号肽数据库检索、分泌途径和亚细胞定位的预测,建立了包含20条枯草芽孢杆菌B.subtilis strain 168内源的信号肽文库,替换初始信号肽并测试其对角蛋白酶胞外表达量的影响。获得10株胞外分泌能力提高的重组菌株,其中含有SP_(dacB)的重组菌株角蛋白酶胞外酶活力达到84.3 KU×m L~(-1),比酶活为182.0 U×μg~(-1),分别为出发菌株的8.1倍和5.0倍。(2)基于信号肽结构、序列及氨基酸性质分析对信号肽进行理性设计,通过信号肽定点突变和片段融合的方法提高了信号肽的胞外分泌能力。获得2株胞外分泌能力提高的菌株,其中WB600-p43NMK-Ker-SP_(bsn)-T2K的胞外酶活力最高达到76.7 KU×m L~(-1),比酶活为167.9 U×μg~(-1)。,相较WB600-p43NMK-Ker-SP_(bsn)分别提高了48%和37%。(3)基于高通量筛选方法,通过突变位点半理性设计和饱和突变策略优化核糖体结合位点,提升m RNA翻译起始速率。获得2株角蛋白酶胞外酶活力提升的重组菌株,其中WB600-R16D12的胞外酶活力达到109.1 KU×m L~(-1),比酶活为221.2 U×μg~(-1),分别为出发菌株的10.5倍和6.4倍。(4)通过对枯草芽孢杆菌进行分泌系统改造提高其分泌能力。在基因组中插入相关分子伴侣编码基因的额外拷贝,包括跨膜辅助蛋白Sec A、Sec DF和后折叠辅助蛋白Prs A,并通过启动子优化调控其表达强度。此外,构建敲除了阻遏CIRCE调节子表达的阻遏物表达基因hrcA的重组菌株。将优化得到的重组质粒分别导入到上述重组菌株中,经发酵验证,重组菌株WB600-Prs A-P8-Ker,其胞外酶活力达到157.6 KU×m L~(-1),比酶活为233.6 U×μg~(-1)分别为出发菌株的15.2倍和6.8倍。

目的 探讨降MK-2206说明书糖三黄片改善糖尿病小鼠糖脂代谢紊乱的作用机制。方法 24只雄性db/db小鼠(自发糖尿病小鼠模型)microbiota dysbiosis随机分成模型组、降糖三黄片低、高剂量组(1.24g/kg、2.48g/kg)和阳性对照二甲双胍组(0.248g/kg),每组6只,同时将6只同窝db/m小鼠为正常组来作对照,待db/db小鼠血糖水平符合糖尿病模型后,药物干预各组按照上述剂量灌胃给药,每天给药1次,连续6周,正常组和模型组给予同等体积生理盐水灌胃。干预前后分别检测各组小鼠体重、摄食量、饮水量、空腹血糖及血脂代谢水平;使用Western Blot法检测小鼠胰腺组织自噬相关蛋白LC3B、P62及Beclin1的表达。结果 与正常组相比,模型组小鼠的体重、饮水量、摄食量、空腹血糖水平、TCHO、TG、LDL-C均明显升高(P<0.05),HDL-C显著降低(P<0.05)。与模型组相比,降糖低、高剂量组、二甲双胍组小鼠的体重、饮水量、摄食量、空腹血糖、TCHO、TG、LDL-C均显著下降(P<0.05),HDL-C显著点击此处上升(P<0.05)。蛋白表达方面,与正常组相比,模型组小鼠P62蛋白均明显升高(P<0.05),LC3B蛋白、Beclin1蛋白均显著降低(P<0.05);与模型组相比,降糖低、高剂量组小鼠的P62蛋白均显著下降(P<0.05),LC3B蛋白、Beclin1蛋白均显著上升(P<0.05)。结论 降糖三黄片可能是通过促进胰岛细胞自噬来改善糖尿病小鼠糖脂代谢紊乱情况。

目的：本研究旨在对甘草附子汤(Gancao Fuzi decoction， 甘草附子汤)治疗类风湿关节炎的作用机制进行网络药理学分析。方法：甘草附子汤的活性成分和靶点从中药系统药理学和药物数据库(DrugBank)中获取。网络药理学方法涉及“药物-成分-靶点”网络图的构建和靶点预测。使用京都基因和基因组百科全书(Kyoto EncyclopediGSK1120212说明书a of Genes and Genomes，KEGG)数据库确定甘草附子汤和类风湿关节炎集群网络的重要信号通路。用分子对接软件(AutoDock vina)对主要活性成分与核心靶点蛋白进行计算机模拟对接，预测主要成分与核心靶点的结合度。动物实验验证甘草附子汤对类风湿关节炎模型小鼠相关蛋白表达的影响。结果：筛选出山柰酚、柚皮素、甘草查耳酮A、异鼠李素、β-谷甾醇等82个有效成分，对应于甘草附子汤的151个目标。此外，1 979个基因与类风湿关节炎密切相关，其中有88个与甘草附子汤的靶点重叠，被认为与治疗相关。功能富集分析表明，甘草附子汤通过调节多种途径发挥其在类风湿关节炎中的药理作用，包括细胞凋亡和自噬，软骨分化、炎症和免疫调节等。动物实验方面，与正常对照组比较，模型对照组小鼠关节肿胀明显，关节炎指数评分显著升高（P＜0.01）以及踝关节中p-ERKCP-690550试剂1、ERK1和COX-2阳性表达均明显升高(P<0.01)；与模型对照组比较，甘草附子汤4.8 g/kg组能显著抑制关节肿胀，明显降低关节炎指数评分（P＜0.05或P＜0.01），能明显改善踝关节病理变化，踝关节中p-ERK1、ERK1和COX-bioanalytical method validation2阳性表达显著降低(P<0.01)。结论：甘草附子汤是通过多组分、多靶点和多途径协同治疗类风湿关节炎。

目的 研究塞拉菌素（Selamectin，Sela）对人结肠癌细胞SW480自噬的影响及蛋白激酶B（Akt）/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路在其中的调控作用。方法 采用四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）检测Sela对SW480细胞的半抑制浓度IC50；克隆形成方法检测Sela对SW480细胞的长期增殖能力抑制作用；Sela与不同死亡抑制剂联合处理、Sela与自噬抑制剂联合处理作用于SW480细胞，MTT法检测Sela对SW480细胞活力的影响；pEGFP-LC3质粒及pmCherry-EGFP-LC3串联质粒转染SW480细胞，荧光显微镜观察检测Sela诱导下自噬体和自噬溶酶体的形成情况。蛋白免疫印迹法测定自噬相关蛋白LC3、p62以及Akt/mTOR通路相关蛋白的表达情况。结果 与对照组相比，Sela处理后SW480细胞活力明显下降，且成浓度依赖性，IC50为18.3 μmol/L；克隆形成实验结果表明，与对照组相比，Sela处理对SW480细胞增殖具有长效抑制作用，差异有统计学意义（P<0.001)；随着Sela作用浓度的升高，SW480细胞内的LC3-II和p62含量均逐渐上升，自噬体不断累积及自噬溶酶体形成减少；自噬抑制剂Wortmanin与Sela联合处理，减少了LC3-II的转换，明显恢复了Sela对SW480细胞的生长抑制作用；而HCQ则增加Pexidartinib了SW480细胞内LC3-II的累积，明显加剧了Se确认细节la对SW480细胞的生长抑制。Sela作用后，SW480细胞中p-Akt，p-mTOR以及下游p-p70S6k的蛋白表达量明显下调。结论 Sela具有抑制结肠癌Simmune recoveryW480细胞的作用，其潜在作用机制可能与抑制Akt/mTOR信号通路从而诱发SW480细胞内自噬体的积累有关。

目的 探究2型糖尿CHIR-99021研究购买病(T2DM)合并桥本甲状腺炎(HT)患者甲状腺功能与糖尿病周围神经病变(DPN)的关系。方法 选取2019年1月—2021年7月首都医科大学附属北京潞河医院医疗保健病区和火箭军特色医学中心内分泌科就诊的168例T2DM合并HT患者，统计DPN发生率，根据是否发生DPN分为DPN组和非DPN组，比较2组一般资料及甲状腺功能指标[促甲状腺素(TSH)、游离三碘甲状腺原氨酸(FT_3)]水平，分析DPN发生的影响因素。将TSH及FT_3水平进行四分位数分层，采用二元Logistic回归分析探讨不同水平TSH及FT_3与DPNstructured medication review发生风险的关系。结果 DPN组年龄大于非DPN组，糖尿病病程短于非DPN组，空腹血糖及TSH水平均高于非DPN组，血清FT_3水平低于非DPN组(P<0.05,P<0.01)。糖尿病病程、空获悉更多腹血糖及TSH、FT_3水平均为T2DM合并HT患者DPN发生的独立危险因素(P<0.05,P<0.01)。TSH四分位数分层显示，与TSH≤1.305μU/ml水平相比，TSH>3.153μU/ml时与DPN发生显著相关，发病率增加了3.533倍(95%CI:1.227,10.170),呈正相关性。FT_3四分位数分层显示，与FT_3≤2.400 pg/ml相比，FT_3 2.715～2.990 pg/ml及>2.990 pg/ml时与DPN发生有统计学意义(P<0.05),且为DPN发生的保护性因素(OR<1)。经多种混杂因素校正后各水平FT_3均与DPN的发生无相关性(P>0.05)。结论 T2DM合并HT患者甲状腺功能紊乱与DPN的发生显著相关，TSH、FT_3是T2DM合并HT患者DPN发生的影响因素。

目的：探讨降糖保肾方配合规范化治疗对早期糖尿病肾病（DN）患者氧化应激及蛋白尿的影响。方法：选取福建中医药大学附属第三人民医院2020年1月至2022年1月期间收治的110例早期DN患者为研究对象，随机分为对照组和观察组，各55例。对照组患者予以合理规范化治疗，观察组患者予以降糖保肾方联合规范化治疗，观察两组患者治疗后临床疗效、治疗前后中医症状积分、氧化应激指标[血清超氧化物岐化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）]、尿白蛋白排泄率（UAER）、24 h尿蛋白量、血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）及治疗期间不良反应发生此网站率。结果：观察组患者治疗总有效率为76.36%，高于对照组的4histones epigenetics3.64%，差异具有统计学意义（P <0.05）。治疗后两组患者的乏力、浮肿、面色晦暗、夜尿频多积分均低于治疗前，且治疗后观察组患者的乏力、浮肿、面色晦暗、夜尿频多积分均低于对照组，差异Vorinostat具有统计学意义（P <0.05）。治疗后两组患者的UAER、24 h尿蛋白定量、血清SCr、BUN水平均低于治疗前，且治疗后观察组患者的UAER、24 h尿蛋白定量、血清SCr、BUN水平均低于对照组，差异具有统计学意义（P <0.05）。治疗后两组患者的血清SOD、CTA水平均高于治疗前，MDA水平均低于治疗前，且治疗后观察组患者的血清SOD、CTA水平均高于对照组，MDA水平低于对照组，差异具有统计学意义（P <0.05）。治疗期间观察组患者的总不良反应发生率为14.55%，对照组总不良反应发生率为9.10%，组间比较，差异无统计学意义（P> 0.05）。结论：降糖保肾方配合规范化治疗可提高治疗早期DN的临床疗效，减少蛋白尿排泄，改善肾功能。

近年来,血栓性疾病发病率逐年攀升,对人类健康造成严重危害,而且全球心血管类疾病的死亡率居高不下,因此对血栓性疾病的预防和治疗迫在眉睫。纤溶酶能专一性水解纤维蛋白,而Excisional biopsy微生物来源的纤溶酶是当前研究的热点,粗糙脉孢菌是一种具有生长周期短,生产成本低,产酶速度快和酶安全性高优势的丝状真菌,已用于发酵制品中,经研究发现其代谢产物中具有纤溶活性的蛋白,而且此来源的纤溶酶未见报道,其可为开发安全高效价廉的新型溶栓药物提供资源。因此本论文利用粗糙脉孢菌固态发酵生产纤溶酶,并针对该来源纤溶酶进行了下列研究:固态发酵条件优化、粗糙PF-03084014溶解度脉孢菌纤溶酶的分离纯化、酶学性质研究和体外条件下酶应用功能研究,得到以下主要研究成果:(1)首先利用粗糙脉孢菌固态发酵农业和工业副产物生产纤溶酶,通过单因素实验、Plackett-Burman设计、最陡爬坡试验和Box-Behnken设计进行发酵工艺优化,优化后培养基组成和发酵条件为:葵花籽粕与麦麸之比为10︰1,加液量96%(v/w),培养基自然p H条件,接种量15%(v/w),发酵温度28℃,发酵时间5 d,使最终发酵粗酶液纤溶酶活力达到403.59 U/m L,与未优化时相比,酶活力提高了近2倍。(2)经过40%～60%饱和度硫酸铵沉淀、透析、SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换层析对发酵粗酶液进行分离纯化,目的酶比活力达到3614.94 U/mg,回收率4.91%,纯化倍数为17.89倍。由SDS-PAGE检测目的酶达到电泳纯,且相对分子量约为32 k Da。(3)目的酶的最适作用温度和pGSK-3抑制剂 H分别为40℃和7.4,接近人体的生理环境,而且其在25～50℃范围内具有一定的热稳定性,在p H值为5.0～9.0范围内具有较高的活力。与对照组相比,金属离子Na~+(119%),Zn~(2+)(119%)和Cu~(2+)(132%)对纤溶酶活力具有显著激活作用,K~+,Mg~(2+)和Mn~(2+)对酶活力的影响不显著,Ca~(2+)(77%)和Fe~(2+)(28%)对酶活力具有显著抑制作用。蛋白酶抑制剂对目的酶活力均表现不同程度抑制作用,N-对甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲基酮(TPCK)和乙二胺四乙酸(EDTA)抑制作用不显著,胃蛋白酶抑制剂(68%)具有显著抑制作用,苯甲基磺酰氟(0%)、大豆胰蛋白酶抑制剂(0%)和抑肽酶(0%)完全抑制纤溶酶活力。巯基类试剂β-巯基乙醇(130%)对目的酶具有显著激活作用,而还原型谷胱甘肽(67%)和氧化型谷胱甘肽(71%)则抑制作用显著;变性剂尿素(54%)和十二烷基硫酸钠(0%)和有机试剂丙酮(85%)对目的酶具有显著抑制作用;蛋白胨(119%)具有显著激活作用,蔗糖、甘油、牛血清白蛋白(BSA)和赖氨酸对纤溶酶活力影响不显著。综上,目的酶的活性中心可能含有二硫键和丝氨酸,属于丝氨酸蛋白酶类。(4)目的酶在富含纤溶酶原和无纤溶酶原的纤维蛋白平板上的酶活力相差0.35%,说明目的酶不具有激酶活性,可直接溶解纤维蛋白。目的酶可以有效降解纤维蛋白原的3种多肽链,降解速度依次是:α链(5 min)>β链(30 min)>γ链(4 h),而且目的酶不具有凝血酶样酶活性。体外探究目的酶对黑山羊血液的抗凝效果,发现含有目的酶的血液组在37℃保温24 h后只形成少量凝块,仍具有良好的流动性,而含有肝素钠(阳性对照)和生理盐水(阴性对照)的血液组完全凝固,说明目的酶在体外具有一定的抗凝血活性,具有被开发成为一种抗凝药物的潜力。同时研究目的酶对黑山羊血液凝块的溶解情况,4 h后,100 U纳豆激酶、100 U目的酶和生理盐水组的溶解率分别是1.34%、3.54%和0.06%,孵育24 h后分别达到8%、14%和0.13%,同剂量的目的酶对血液凝块溶解率高于纳豆激酶,说明目的酶具有一定的溶栓能力。体外模拟目的酶对血液和胃液环境的耐受力,在模拟血液环境中于37℃保温4 h后酶活力变化不显著,表明目的酶在短时间内可以耐受血液环境;将目的酶分别在模拟进食前、进食蔗糖和进食蛋白类物质后的胃液中于37℃保温4 h后时,相对酶活力分别为0%、0%和82%,表明目的酶在被蛋白类物质保护的情况下可以耐受胃液环境,推测该酶可能具有被开发成静脉注射和口服药物的潜力。

目的评估基因治疗药物AAV5-脂蛋白脂酶变异体（GC304）在小鼠体内的symbiotic cognition毒性。方法①急性毒性研究中，40只C57BL/6N小鼠随机分为2组，分别为溶媒组和受试物组，单次尾静脉注射后，进行连续15d临床症状观察、体重和摄食量测定，于第15天剖检。②长期毒性研究中，440只小鼠随机分为4组，分别设置溶媒组，受试物低剂量组（1×10~(13 )vg·kg~(-1)）、中剂量组（5×10~(13)vg·kg~(-1)）和高剂量组（1.5×10~(14 )vg·kg~(-1)），单次尾静脉注射后，对动物体重、摄食量、血液学、血清生化、免疫毒性及免疫原性等毒性指标进行测定。给药后4周和6个月时解剖，动物进行组织病理学检查，并在2、4周，3、6个月采用qPCR的方法检测GCAZD1152-HQPA研究购买304在动物各个脏器的分布和表达情况。结果①急性点击此处毒性研究中，动物临床症状、体重、摄食量未见异常，未见与GC304相关的大体病理学改变。②长期毒性研究中，动物临床症状、体重、摄食量、细胞因子和T淋巴细胞亚群未见与GC304相关的明显异常。GC304能够降低血浆中甘油三酯以及与抗药抗体相关的白蛋白/球蛋白比值下降，能够诱导抗AAV5结合抗体和中和抗体的产生，并持续至给药后6个月。给予GC304后，未检测到抗LPL（LipoproteinLipase）抗体。组织病理学结果显示，小鼠给药后4周，注射部位出现与药物相关的炎性细胞浸润，至给药后6个月可见恢复。与药物相关的改变为脾脏生发中心活跃伴易染体巨噬细胞增多、腹股沟淋巴结生发中心活跃伴易染体巨噬细胞增多。qPCR检测结果显示，GC304在小鼠外周血及脏器广泛分布和表达，但在肝脏中分布和表达显著高于其他脏器。结论C57BL/6N小鼠单次静脉给予GC304后，主要在肝脏中表达和分布，并且动物耐受性良好，未见明显毒性反应，为该药物进入临床试验提供参考。

目的探讨血清胱抑素C(CysC)与IgA肾病临床及病理特征的相关性。方法收集2010年1月至2021年1月在上海中医药大学附属龙华医院经肾活检确诊的原发性IgA肾病421例进行回顾性分析。根据肾活检时血清CysC水平分为血清CysC高水平组(≥1.03 mg/L)及CysC正常组, 对患者的临床资料及病理指标进行比较, 采用Spearman法分析估算的肾小球滤过率(eG获悉更多FR)与血清CysC的相关性, 多元线性回归分析与血清CysC水平相Fusion biopsy关的临床病理因素, 并用受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)评估联合血清CysC预测相关病理损伤的能力。结果 CysC高水平组患者的年龄、合并高血压、血肌酐、尿素及血尿酸水平均明显高于血清CysC正常组, 而eGFR水平明显低于血清CysC正常组(P均0.05)。Spearman相关性分析显示, 血清CysC与eGFR呈负相关(r=-0.744, P0.001)。在病理损伤方面, CyRoxadustat使用方法sC高水平组在肾小管萎缩与肾间质纤维化及肾小动脉管壁增厚等程度高于CysC正常组(P均0.05)。多元线性回归分析提示, 高血压、血肌酐、尿素、血尿酸、肾小管萎缩与肾间质纤维化及肾小动脉管壁增厚与血清CysC水平具有相关性(标准回归系数β值分别为0.048、0.299、0.260、0.134、0.195、0.068, P均0.05)。在临床因素的基础上加入血清CysC后, 能提高对肾小管萎缩和肾间质纤维化的预测效能[AUC分别为0.829(95%CI 0.787～0.870)、0.847(95%CI 0.808～0.886), P0.05]。结论原发性IgA肾病患者年龄偏大、合并高血压、肾功能水平较差、病理损伤程度较重时, 更易出现血清Cys C水平升高。血清CysC与高血压、血肌酐、尿素、血尿酸、肾小管萎缩与肾间质纤维化及肾小动脉管壁增厚相关。联合血清CysC水平可有效提高对肾小管萎缩与肾间质纤维化的预测能力。

目的 探讨沙格列汀对2型糖尿病伴缺血性脑卒中患者血糖水平及认知功能的影响。方法 选择2018年Fulvestrant采购11月至2020年11月焦作市人民医院收治的150例2型糖尿病伴缺血性脑卒中患者为研究对象。将患者随机分为观察组和对照组，每组75例。2组患者均给予常规治疗，对照组患者在常规治疗基础上给予二甲双胍治疗，观察组患者在常规治疗基础上给予沙格列汀治疗，均连续治疗3个月。比较2组患者治疗前后的血糖指标[空腹血糖(FBG)、餐后2 h血糖(2 h PBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)]、血糖漂移幅度[日内平均血糖漂移幅度(MAGE)、日间血糖漂移幅度(MODD)、平均餐后血糖漂移幅度(MPPGE)、血糖水平标准差(SDBG)]、肾功能指标[血肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)、血清胱抑素C(Cys C)]、认知功能[蒙特利尔认知评估量表(MoCA)评分]及不良反应发生情况。结果 治疗前2组患者FBG、2 h PBG、HbA1c比较差异均无统计学意义(P>0.05);2组患者治疗后FBG、2 h PBG、HbA1c水平均低于治疗前(P<0.05);治疗后，2组患者的FBG、2 h PBG、HbA1c水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗前2组患者的MAGE、MODD、MPPGE、SDBG比较差异均无统计学意义(P>0.05);治疗后，2组患者的MAGE、MODD、MPPGE、SDBG均低于治疗前(P<0.05),且观察组患者的MAGE、MODD、MPPGE、SDBG低于对照组(P<0.05)。治疗前2组患者的SCr、BUN、Cys C水平比较差异均无统计学意义(P>0.05);2组患者治疗后的SCr、BUN、Cys C水平均低于治疗前(P<0.05);治疗后，2组患者的SCr、BUN、Cys C水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗前2组患者的MoCA评分比较差异无统计学意义(P>0.05);2组患者治疗后的MoCA评分均高于治疗前(P<0.05);治疗后，2组患者的MoCA评分比较差异无统计学意义(P>0.05)。观察组和对照组患者不良反应发生率分别为12.00%(V180I genetic Creutzfeldt-Jakob disease9/75)、14.67%(11/75),2组患者的不良反应发生率比较差异无统计学意义(χ~2=0.231,P>0.05)。结论 沙格列汀能有效降低2型糖尿病伴缺血性脑卒中患者的血糖水平、改善患者的肾功能和认知功能，获得Nirmatrelvir细胞培养与二甲双胍相同的治疗效果，其对血糖漂移幅度的改善作用更强，且安全性佳。