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【目的】RAC/ROPs是一类植物特有的小G蛋白，作为Ferroptosis抑制剂分子开关参与众多的植物信号转导途径。OsRAC3通过与selleck FUT-175细胞分裂素信号组分互作，调控水稻Oryza sativa L.冠根发育，但是否影响水稻地上部分的性状尚不清楚。本研究主要分析OsRAC3对水稻穗发育以及产量性状的影响。【方法】对水稻OsRAC3promoter::GUS转基因植株的花序组织进行GUS染色，分析OsRAC3的表达模式。分析转基因材料持续激活型突变体(CA-osrac3)和显性失活型突变体(DN-osrac3)2种试验材料的每穗粒数、粒长、粒宽、千粒质量等主要农艺性状。【结果】OsRAC3在花序分生组织、雄蕊和雌蕊中强烈表达；CA-osrac3株系的穗粒数减少，籽粒更加饱满，粒长、粒宽、千粒质量均显著高于野生型；DN-osrac3株系的穗分枝数少且育性差，籽粒粒长、粒宽、千粒质量则显著低于野生型。【结论】OsRAC3影响水稻穗的发育过程，持续激活型突变体CA-osrac3促进水稻籽粒的发育；OsRAC3在水稻高产育种和遗传改良中具有plant immune system重要的应用价值。

线粒体是细胞有氧呼吸的主要场所,被称为“细胞动力工厂”,它参与了细胞的分化、信息的传递、细胞凋亡、自噬等过程。细胞内微环境尤其是线粒体微环境,如温度、极性、酸度、粘度和乏氧等,对细胞功能的发挥至关重要。其中线粒体粘度与细胞内物质的传递、化学信号的运输和生物大分GSK126价格子相互作用的过程密切相关;乏氧程度会影响放疗、化疗等癌症治疗的效果,甚至会导致肿瘤产生耐药性。线粒体微环境异常与许多疾病,例如心力衰竭、肝损伤、癌症的发生发展密切相关。因此,开发能够实时检测细胞粘度和乏氧水平变化的方法,对于了解细胞功能和阐明相关疾病发生发展机制具有INCB28060核磁重要意义。荧光成像方法具有检测灵敏度高、识别选择性好,非侵入式检测,对细胞损伤较小等优点,是原位实时研究细胞及活体内生物事件的理想方法。本论文以线粒体粘度和乏氧微环境为研究对象,设计合成了系列近红外荧光探针,用于细胞及小鼠活体内粘度和乏氧的原位实时成像监测。具体的研究内容如下:1、基于二氢氧杂蒽(DHX)染料Military medicine,以吡啶盐为电子受体基团偶联不同的供电子基团,通过增强分子内电荷转移(ICT)和引入更多的分子转子,设计合成系列近红外(NIR)粘度探针。筛选出对粘度响应信噪比高,识别选择性好,并具有良好的线粒体靶向性和锚定能力的探针DHX-V-3。利用探针DHX-V-3,实现了对脂多糖(LPS)或制霉菌素刺激下对He La细胞粘度变化的实时成像。此外,基于NIR探针优良的组织成像深度,DHX-V-3被成功应用于炎症模型小鼠体内粘度变化的可视化。2、以生物素为肿瘤靶向基团、对硝基溴苄为硝基还原酶响应基团,设计合成了一个用于检测肿瘤细胞内硝基还原酶水平以评估细胞乏氧程度的近红外荧光探针DHX-Bio-NO_2。探针DHX-Bio-NO_2对硝基还原酶具有良好的线性响应,检测不受常见生物活性物种的干扰,并具有较低的细胞毒性;细胞成像实验结果表明,探针DHX-Bio-NO_2能够特异性靶向肿瘤细胞,具有定量测定肿瘤细胞内硝基还原酶的能力。利用该探针,根据乏氧程度的差异,还实现了正常细胞和肿瘤细胞的区分。

葫芦科作物是我国重要经济作物。目前在中国危害葫芦科作物生长的病毒超过29种,每年都造成大量的经济损失。其中小西葫芦黄花叶病毒(zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)被认为是危害作物的马铃薯Y病毒属十大重要病毒之一,该病毒严重危害我国北方甜瓜的产量和质量。本研究对试验室前期收集的ZYMV材料进行分离纯化接种进而获得纯化毒源,随后接种于超感甜瓜品种XMZ11、抗病甜瓜品种PI414723和普通感病品种甘甜3号三种甜瓜材料上,验证三种不同病毒抗性材料的抗病能力,分析不同ZYMV分离物对甜瓜的致病分化,通过RT-PCR扩增以及一代桑戈尔测序,人工拼接获得22份ZYMV分离物全长基因组核苷酸序列,并对其进行全长基因组序列一致性、系统进化和重组分析,分析中国ZYMV分离物的遗传多样性及遗传交流,取得结果如下:(1)利用枯斑寄主和接种后检测方法对采集自河南、新疆、广西、重庆、四川等省份的ZYMV侵染病样进行分离纯化,获得22株ZYMV分离物。(2)在三个甜瓜材料上人工接种22株ZYMV分离物,对发病症状、发病率和病情指数进行分Hellenic Cooperative Oncology Group析表明:XMZ11发病症状多为整株坏死和沿叶脉坏死,甘甜3号发病症状多为疱斑和花叶,PI414723发病症状多为产生坏死斑;XMZ11的发病率最高,其中6份发病率达到100%,最低发病率也超过60%。PI414723发病率最低,仅有1份发病率达75%,7份发病率仅为12.5%。甘甜3号发病率介于XMZ11和PI414723之间,7份发病率100%,2份为12.5%;XMZ11病情指数最高,最高可达100,最低为28.33;PI414723病情指数最高INCB018424可达54.16,最低为0。甘甜3号病情指数最高可达60,最低为5;不同分离物在甜瓜上存在明显的致病性分化,如DB3、TN1和JLP在三个甜瓜品种中均有较高的致病性,而JS5-23、KF34和HX6-X6致病性均较低,其他分离物也表现出一定的差异。(3)对22份ZYMV株系的全长基因组核苷酸序列进行一致性比对表明:22份ZYMV分离物从全基因组核苷酸序列水平属于ZYMV病毒种,且表现出多样性;系统进化分析表明世界范围内ZYMV的系统进化与ZYMV分离物的地理位置存在相关性,与分离物寄主没有相关性;22份分离物中17份分离物聚集在在G-C类群,是中国优势类群,来自广西的3份和四川的1份被聚集在G-D类群,而来自新疆喀什的1份分离物被分配到G-A类群,也再次验证本研究中的ZYMV群体存在较丰富的多样性。重组分析发现本研究中存在8个种间重组分离物,表明国内的分离物不仅在国内存在遗传信息交流,同时与国外分离物间也存在一定的遗传信息交流。本研究分析了国内的22份ZYMV分离物群体在不同类型的甜瓜S63845细胞培养寄主上的致病性分化,同时分析了它们全长基因组序列的一致性,系统进化和重组分析明确了它们的遗传多样性及遗传信息交流,为筛选抗ZYMV材料或者培育抗性品种提供生物学背景清晰的病毒材料和理论依据。

目的:抑郁症是一种常见的慢性精神障碍疾病,其致病原因复杂且康复率较低。目前,抑郁症的临床诊断主要根据患者主观报告及医生诊断结果,存在较强的主观性和高漏诊、误诊率。本研究使用脑电图(EEG)技术测量脑电生理指标,旨在寻找更精确的抑郁症检测和诊断生物标志物,并探究抑郁症脑功能结构变化和发病机制。方法:在某综合性三甲医院招募了79名经过DSM-5确诊且未购买BYL719服药的抑郁症患者以及来自社区的54名健康对照组被试。采用Neuroscan公司的64导脑电检测仪收集两组被试的6分钟静息态脑电数据,对预处理后的数据进行功率谱分析,计算了δ(1-3Hz)、θ(4-7Hz)、α(8-13Hz)、β(14-30Hz)四个频段的绝对功率值,以及左右脑半球的不对称性指数,并对比了两组间的差异。此外,使用流调中心用抑郁量表、状态特质焦虑量表、情感强度量表分别对被试的抑郁水平、焦虑水平以及情感强度进行数据采集,并使用相关分析探究生理指标与量表得分之间的关系。结果:(1)抑郁组被试在δ、θ、α和β四个频段上的绝对功率值均显著高于对照组。(2)其中δ、θ和α频段上的差异在前额叶、中央区、顶叶及枕叶区均有体现,而β频段的差异仅集中在中线区附近的额叶、中央区及顶叶区。(3)两组均未发现额叶α的左右半球不对称,但发现了两组被试均存在δ波在额区的右侧不对称及颞区的左侧不对称。(4)两组被试在抑郁及特质焦虑量表得分上有显著差异(t=-14.05, p <0.001; t=-3.593, p <0.001)。(5)四个频段的功率值与两组被试的抑郁Mutation-specific pathology水平之间均不PF-03084014临床试验存在显著相关。α与θ功率值与抑郁被试的特质焦虑水平呈显著正相关(r=0.31, p <0.01; r=0.29, p<0.05),而对照组被试中未发现显著相关结果。结论:脑电功率值差异有望成为可靠的抑郁症识别生物标志物,但额区的半球不对称性在抑郁症诊断中的潜在作用仍有待进一步探索。

[目的] 探讨骨髓间充质干细胞(BMSCs)对放射性肺损伤（RILI）的治疗作用，初步探讨其作用机制；[方法] 将45只健康成年雄性C57BL/6小鼠随机分为Control组、ModBelumosudil体内el组、BMSCs组。Model组和BMSCs组单次胸部照射剂量为20Gy，正常对照组不接受x线照射，照射后6h内，BMSCs组以1×10~(6 )个BMSCs通过尾静脉注射小鼠体内。第5周取肺组织HE染色观察肺组织病理变化；免疫组织化学染色观察肺组织炎症因子IL-6和TNF-α的表达变化；巨噬细胞免疫荧光染色观察肺部巨噬细胞极化的变化；免疫蛋白印迹检测肺组织上皮间质转化标志物E-cadherin、N-cadherin、Vimentin蛋Y-27632 IC50白的表达。[结果] 辐射后，Model组肺组织血管扩张充血，肺间隔明显增厚，炎细胞浸润，BMSCs组小鼠肺组织的上述病变明显减轻；Model组明显增高的在炎症因子IL-6和TNFinfection-related glomerulonephritis-α的表达在BMSCs组均明显下调（P <0.01，P <0.05)；BMSCs的治疗显著增加肺部巨噬细胞向M2型极化，同时降低了RILI小鼠体内异常增高的N-cadherin和Vimentin的蛋白水平(P <0.05， P <0.01)。[结论] BMSCs对小鼠RILI有明显的治疗作用，其机制可能与BMSCs促进巨噬细胞M1型向M2型极化有关。

背景:内毒素血症(endotoxemia,ETM)是现代危重症医学面临的重要临床问题,病情凶险,迁延不愈可引起多器官功能障碍综合征,是医院危重症患者死亡的首要原因。脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性菌释放的内毒素,作为一种极强的炎症反应刺激物,在ETM的病程发展中起着关键作用。虽然抗生素是目前ETM治疗的基础,但持续强烈的炎症反应限制了它们的有效性,迄今尚无ETM特效诊疗策略。ETM心功能障碍被认为是ETM最严重的综合征之一,以心肌收缩功能受损和顺应性降低为特征,伴随着过度的心脏炎症。在ETM早期病理阶段,LPS诱发细胞内质网(endoplasmic reticulum,ER)Ca~(2+)泄漏,导致平均动脉血压和心率急剧增加;晚期阶段,LPS可直接激活Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)信号通路,下游促炎因子的过度爆发引起细胞因子风暴,造成心肌细胞收缩力下降和致命的心律失常,从而加重心功能障碍。经典瞬时受体电位通道(classical transient receptor potential,TRPC)是Ca~(2+)可通透的非选择性阳离子通道,课题组前期发现TRPC重要地参与ETM心功能障碍的发展,然而其具体作用机制尚未阐明。目的:本课题拟在前期基础上,从动物、组织、细胞到分子水平,多层面系统性阐释TRPC调控ETM心功能障碍的关键分子机制和TRPC活性结构域;基于TRPC活性位点,筛选出高效抑制剂,在体内外多种ETM模型中评价靶向TRPC对ETM心功能障碍的治疗效果,为寻找新的有效治疗靶点和新药开发提供重要的实验依据。方法:(1)TRPC在ETM心功能障碍中的作用:(1)采用LPS腹腔注射构建ETM小鼠模型,Western blot法检测小鼠心肌中TRPC家族蛋白的表达。(2)应用全身性Trpc1敲除和Trpc6敲除小鼠构建LPS诱导的ETM模型,绘制生存曲线,比较小鼠生存时间;采用Power Lab记录仪、超声影像系统评价小鼠心功能;苏木素和伊红(hematoxylin and eosin,H&E)染色法和酶联免疫法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)评价心肌组织病理损伤程度;免疫荧光实验检测心肌组织中TRPC1和TRPC6的分布情况。(3)分离原代成年小鼠心肌细胞和骨髓来源巨噬细胞(bone marrow-derived macrophages,BMMs),应用Ca~(2+)成像系统检测LPS引起细胞内Ca~(2+)浓度(Ca~(2+)concentration,[Ca~(2+)]_i)的变化。(2)TRPC促进ETM心肌中TLR4介导的炎性级联反应:(1)Trpc1敲除和Trpc6敲除小鼠分别构建ETM模型,应用RNA-seselleckchem JNJ-42756493q对小鼠心肌组织差异表达基因进行聚类和富集分析。(2)采用ELISA和免疫组化实验检测促炎因子(TNF-α、IFN-β、IL-6和IL-1β)和炎性蛋白(MIP-1α)的表达。(3)Western blot法检测NF-κB p65核内表达、MAPK家族蛋白磷酸化,TLR4以及My D88、TRIF依赖通路关键蛋白的表达。(3)TRPC介导Ca~(2+)调蛋白(calmodulin,Ca M)调控TLR4信号通路:(1)分析RNA-seq数据中Ca~(2+)通路显著变化基因。(2)Western blot法和ELISA检测Ca M及下游钙调神经磷酸酶活力和NFAT核内表达;免疫共沉淀实验(co-immunoprecipitation,co-IP)验证TRPC1或TRPC6与Ca M蛋白的结合。(3)采用co-IP、邻位连接技术(proximityligationassay,PLA)、微量热泳动(microscale thermophoresis,MST)和免疫荧光实验在组织、细胞和蛋白水平检测Ca M与TLR4蛋白的结合。(4)在LPS刺激的成年小鼠心肌细胞infection of a synthetic vascular graft和BMMs中,应用Ca M不同结构域抑制剂,筛选Ca M与TLR4的结合域:通过co-IP检测Ca M与TLR4的结合、Western blot法和ELISA检测MAPK家族蛋白磷酸化水平和促炎因子含量。(5)TLR4与Ca M的氨基酸结合位点研究:在HEK-293T细胞中转染Ca M和关键位点突变的TLR4质粒,通过co-IP和免疫荧光技术检测TLR4与Ca M的氨基酸结合位点;Ca M靶蛋白数据库筛选TLR4高评分结合基序,将这些TIR域非典型性异亮氨酸-谷氨酰胺样(isoleucine glutamine,IQ)基序合成TLIQ系列小肽后,采用非变性凝胶电泳和MST筛选Ca M结构中与TLR4结合的序列。(6)应用分子对接虚拟筛选Ca M与TLR4的潜在结合位点。(4)TRPC介导IP3R调控ER/肌浆网(sarcoplasmic reticulum,SR)Ca~(2+)泄漏信号通路:(1)对野生型乳小鼠心肌细胞Itpr1、Itpr2和Ryr2使用si RNA基因沉默和/或抑制剂阻断后,采用Ca~(2+)成像系统检测LPS引起的[Ca~(2+)]_i。(2)对分离野生型、Trpc1/6敲除的成年/乳小鼠心肌细胞进行抑制剂阻断后,采用Ca~(2+)成像系统检测LPS引起的[Ca~(2+)]_i。(3)流式细胞分选技术分离原代心脏留驻巨噬细胞,采用Ca~(2+)成像系统检测LPS引起的[Ca~(2+)]_i。(4)分离野生型小鼠BMMs,对Itpr1使用si RNA敲减或抑制剂阻断后,采用Ca~(2+)成像系统检测LPS引起的[Ca~(2+)]_i。(5)ETM小鼠注射IP3R抑制剂低分子量肝素(low molecular weight heparin,LMWH),采用超声影像系统检测心功能,绘制生存曲线,比较小鼠生存时间。(6)采用co-IP、PLA和免疫荧光实验检测TRPC、IP3R1、Ca M和TLR4蛋白之间的结合。(5)TRPC抑制剂的虚拟筛选与体内外评价:(1)采用SYBYL分子对接软件筛选与TRPC3/6蛋白C端结构域结合的抑制剂;采用MST检测TRPC1 C端融合蛋白与抑制剂的亲和力。(2)在LPS刺激的乳小鼠心肌细胞中给予不同浓度SKF-96365(SKF),进行细胞层面药效评价:采用ELISA检测促炎因子含量,Ca~(2+)成像系统检测[Ca~(2+)]_i,co-IP检测TRPC、IP3R1、Ca M和TLR4蛋白互作情况。(3)LPS诱导ETM小鼠和盲肠结扎穿孔术(cecum ligation and puncture,CLP)诱导脓毒症小鼠分别注射SKF,进行动物层面药效评价:采用超声影像系统检测心功能;H&E染色法评价心肌组织病理损伤程度;ELISA检测血清中心肌损伤标志物和促炎因子含量;绘制生存曲线,并比较小鼠生存时间。结果:(1)TRPC在ETM心功能障碍中的作用:(1)TRPC1和TRPC6是LPS刺激后小鼠心肌中TRPC家族蛋白表达变化最显著的两种亚型。(2)Trpc1/6敲除显著提高ETM小鼠的生存率,明显缓解心功能相关的平均动脉血压、心率和射血分数骤降,显著抑制心肌组织炎性浸润和损伤,说明TRPCs参与了ETM心功能障碍的发生发展。(3)ETM心肌中TRPC1和TRPC6高表达于心肌细胞和巨噬细胞。在有/无Ca~(2+)的细胞外液中,Trpc1/6敲除均显著抑制LPS诱导的BMMs/成年小鼠心肌[Ca~(2+)]_i升高,说明TRPC1/6参与了LPS引发的ER/SR Ca~(2+)释放。(2)TRPC促进ETM心肌中TLR4介导的炎性级联反应:(1)RNA-seq数据分析表明Trpc1/6敲除显著影响先天免疫反应调控中的TLR信号通路。(2)在小鼠心肌中,Trpc1/6敲除显著抑制LPS诱导的促炎因子释放,MIP-1α阳性表达,NF-κB p65的核转位、MAPK家族蛋白和IRF3的磷酸化,TLR4以及My D88、TRIF依赖通路关键蛋白的表达。(3)TRPC介导Ca M调控TLR4信号通路:(1)Trpc1/6敲除导致ETM小鼠心肌中Ca M蛋白表达显著升高,下游钙调神经磷酸酶活力和NFAT3核内表达明显下调;在小鼠心肌中,Ca M与TRPC1和TRPC6明显结合。(2)Trpc1/6敲除的小鼠心肌中,Ca M与TLR4蛋白直接结合。LPS诱导的Trpc1/6敲除的小鼠心肌细胞中,Ca M与TLR4共表达于细胞膜附近。(3)在Trpc1/6敲除的成年小鼠心肌细胞/BMMs中,Ca M的疏水口袋区抑制剂W-7可阻断Ca M与TLR4结合,翻转了Trpc1/6敲除对LPS刺激的炎症通路的抑制作用;而Ca M的E-F手区阻断剂CALP1无此调控作用,说明与TLR4结合的Ca M结构域为其疏水口袋部位。(4)在HEK293T细胞中,Ca M与V693位点突变的TLR4没有互作,说明V693是TLR4与Ca M的结合位点之一。(5)Ca M与TLIQ2小肽表现出非Ca~(2+)依赖的结合,说明TLR4 TIR域的非典型IQ基序段也可以与Ca M结合。(6)Ca M的疏水口袋域的Ala2、Glu8、Asp123、Ile126和Asp130可以与TLR4的αB-αC螺旋中的Poc位点Val693以及TLIQ基序Lys729、Ser730、Arg731、Trp746和Cys747位点结合。(4)TRPC介导IP3R调控LPS诱导的ER/SR Ca~(2+)泄漏信号通路:(1)在成年/乳小鼠心肌细胞中,Ry R2拮抗剂可部分抑制LPS引发的Ca~(2+)释放,Trpc1/6敲除可部分抑制剩余的Ca~(2+)释放,而IP3R拮抗剂可完全阻断Ca~(2+)释放,说明TRPC1和TRPC6参与了IP3R所介导的SR Ca~(2+)释放。(2)在巨噬细胞中,LPS引起的[Ca~(2+)]_i升高被Itpr1敲除显著抑制,被Trpc1/6敲除部分抑制,说明IP3R1是介导ER释Ca~(2+)的主要亚型,TRPC1和TRPC6参与该释Ca~(2+)过程。(3)LMWH不能改善ETM小鼠心肌收缩功能或提高生存率,提示阻断Ca~(2+)释放不足以治愈ETM心功能障碍。(4)LPS刺激后,野生型的心肌中IP3R1与TRPC1/6的互作增加,Trpc1/6敲除心肌中Ca M与IP3R1出现明显互作;W-7翻转了Trpc1/6敲除所抑制的LPS引发的[Ca~(2+)]_i升高。以上结果说明:LPS刺激后,TRPC1/6参与IP3R介导的ER/SR Ca~(2+)释放;Trpc1/6敲除后,与TRPC1/6解离的Ca M可阻断IP3R通道开放。(5)TRPC抑制剂的虚拟筛选与体外活性评价:(BIBW2992体外1)分子对接结果表明:非特异性抑制剂SKF与TRPC3/6的CIRB结构域有结合。(2)SKF与TRPC1 C端融合蛋白的亲和力为K_D=0.65±0.13 m M。(3)在细胞水平,SKF浓度依赖地抑制LPS诱导的促炎因子分泌、心肌细胞[Ca~(2+)]_i升高。(4)在蛋白水平,SKF浓度依赖地抑制LPS刺激后TRPC1/3/6蛋白的表达;降低TRPC1分别与Ca M和IP3R1的结合,明显增加Ca M分别与TLR4和IP3R1的结合。(6)TRPC抑制剂的体内药效评价:(1)LPS诱导的ETM小鼠中,SKF剂量依赖地改善心肌收缩功能障碍、缓解心肌组织病理损伤、抑制血清中心肌损伤标志物和促炎因子分泌。(2)SKF多次给药能显著提高ETM小鼠的生存率。(3)CLP诱导的脓毒症小鼠中,SKF剂量显著改善心肌收缩功能障碍、缓解心肌组织病理损伤,抑制血清心肌损伤标志物和促炎因子分泌,明显提高CLP小鼠生存率。结论:本论文系统分析并阐明了TRPCs直接参与并促进ETM心功能障碍的关键病理发生机制。首次明确了Trpc1或Trpc6敲除可通过解除其与分子伴侣Ca M的结合,阻断巨噬和心肌细胞的TLR4受体激活,对My D88和TRIF依赖性炎症通路均产生抑制作用,同时阻断LPS导致的细胞ER/SR Ca~(2+)泄漏,从而产生显著的LPS所致心功能障碍的保护作用。值得一提的是,TRPC抑制剂SKF可通过作用于TRPC上的Ca M/IP3R结合域,在LPS诱导的小鼠ETM和CLP模型中均显示出强大的心脏保护作用,并显著降低死亡率。研究证实了TRPCs是ETM治疗的潜在新靶点,并为ETM治疗提供了一种潜在的高效特异性新方法。

为了明确猪萨STM2457核磁佩罗病毒在仔猪腹泻病情中的作用,2016—2020年采集上海市及周边11个猪场腹泻病料,共计1 446份。利用RT-PCR方法对其进行PSV筛检,并对阳Angiogenesis抑制剂性样品进行病原分离及病毒特性研究。结果显示:共筛检出256份PSV核酸阳性样品,阳性率17.7%。从阳性样品中成功分离到2株PSV病毒,全基因序列遗传进化分析显示2株PSV分离株聚集在中国PSV毒株集群上,分离株在3D区域4 696—5 945 bp处存在重组区域。病毒核苷酸分析发现中国PSV毒株与韩国PSV毒株核苷酸相似性为87%—88.5%,与欧洲PSV毒株核苷酸相似性为84.9%—87.3%。对VP1基因氨基酸序列分析发现分离株与参考株存在氨基酸位点突变,中间氨基酸序列保守,无突变及插入和缺少现象。PSV分离株与参考株均含有173位潜在糖基化位点,VP1Hereditary thrombophilia蛋白分子表面抗原表位分布均匀。该研究可为猪萨佩罗病毒病原学及其疫苗的研制奠定基础。

目的 制备一种花生四烯酸脂质体MRI-directed biopsy(liposomes containing arachidonic acid, LipGSK J4生产商o-DAPE),研究该脂质体的活性氧(reactive oxygen species, ROS)响应性和毒性情况，考察其促进肿瘤细胞发生铁死亡的能力。方法 以粒https://www.selleck.cn/products/Decitabine.html径、Zeta电位为评价指标优化Lipo-DAPE的处方；通过透射电子显微镜和动态光散射表征脂质体的形貌、稳定性等理化性质，考察其ROS响应性及药物释放速率；通过激光扫描共聚焦显微镜观察4T1细胞对脂质体的摄取行为；通过MTT实验考察Lipo-DAPE的抗肿瘤活性；以细胞内ROS、脂质过氧化物及谷胱甘肽水平考察Lipo-DAPE促进肿瘤细胞铁死亡的能力。结果 Lipo-DAPE粒径为(74.4±1.0)nm, Zeta电位为(29.4±1.2)mV,可在48 h内维持稳定；在模拟肿瘤微环境ROS条件下脂质体骨架崩解，促进药物释放；Lipo-DAPE能够被4T1细胞摄取并抑制细胞活力；此外，Lipo-DAPE促进了细胞中ROS及脂质过氧化物含量，降低了GSH水平。结论 Lipo-DAPE具有促进肿瘤细胞发生铁死亡的效果，为新型全活性纳米药物递送载体的设计提供了新思路与理论依据。

表观转录学的兴起衍生出了诸多生物信息学分支,其中就有在生信研究中较为广泛的RNA化学修饰问题,该领域主要研究修饰位点的检测、测序以及不同修饰对生物遗传的影响。迄今为止,已有超过160种RNA化学修饰被发现,这些修饰对RNA的配对、剪接翻译以及转录稳定性方面都有着重要影响。而在信息技术发展前,RNA化学修饰检测主要依赖于高通量测序技术和质谱技术等实验方法,这些方法虽然能检测到修饰位点,但实验所耗费的时间和经济成本普遍较高,检测效率较低。因此开发计算机算法检测RNA化学修饰是必要的。另外,在测序问题中非平衡数据的测序又是重难点,因Ferrostatin-1使用方法为传统机器学习模型大多适用于平衡数据,而本课题在两种RNA化学修饰(m6A和m6Am)的序列中获得重要特征,利用深度学习模型的类权重处理非平衡数据,均表现出了良好的预测性能。N~6-甲基腺苷(m6A)是一种RNA转录后修饰,是典型的RNA甲基化修饰之一,主要在m RNA编辑、降解等方面发挥重要作用。针对m6A,本课题提出了一种基于多分支型CNN的m6A位点预测模型m6A-CNLs,该模型首先采用三种编码方式编码RNA序列,再将三种编码信息分别输入到三个卷积神经网络模型(CNN)中获得三组新的特征,然后再将三种特征拼接并入新的特征空间,最后进行分类预测,另外我们在每个CNN中加入了LSTM模型,用于捕获前后文信息。最终在该模型下,本课题研究的m6A非平衡数据集在独立测试集上取得Sn=0.782;Sp=0.968;ACC=0.951;MCC=0.719,在交叉验证上m6A-CNLs模型也显示出了良好的性能,充分说明该模型在m6A位点预测上效果显著可靠。N6,2’-O-二甲基腺苷(m6Am)是一种较新的RNA可逆修饰,对m RNA的生命过程有着重要影响,但现阶段对m6Am的生物学功能探索还不够。所以本课题将Transformer和双向门控循环单元(Bi-GRUgut micobiome)有机结合,利用顺序自然数编码提取特征,提出了一种新的端到端“双胞胎”深度学习网络m6Am Twins。与很Panobinostat细胞培养多算法相比,该模型在两组非平衡数据集上的性能均有明显提升,在独立测试集上全转录本数据的Sn、Sp、ACC、MCC分别为0.709、0.921、0.902、0.53,成熟RNA数据的Sn、Sp、ACC、MCC分别为0.645、0.945、0.918、0.545。另外通过训练集的交叉验证结果,进一步说明了该模型具有良好的泛化能力。本课题研究的m6A和m6Am位点,都是目前RNA化学修饰位点中的热门,同时本课题从生物特性和进化规律角度出发,开发了基于两种修饰位点非平衡数据下的预测模型,为该领域非平衡分类以及RNA化学修饰的生物学功能研究提供了一定的帮助。

大口黑鲈(Micropterus salmoides,Largemouth bass)是我国重要淡水养殖鱼类,其产量以年均9%的速度增长。随着大口黑鲈养殖规模化程度的增加,日益恶化的水体环境导致病害频发,造成重大经济损失。其中,大口黑鲈虹彩病毒(Largemouth bass virus,LMBV)是种苗培育和商品鱼生产中危害最为严重的病原之一,一旦暴发,引起的大口黑鲈死亡率达60%以上。众所周知,免疫防控、药物防控和生态防控是水产养殖病害防控的三大手段,而目前,疫苗研究和应用在我国发展十分缓慢,尤其,LMBV疫苗更是如此,因此,药物防控成为该病害防控最直接、最有效的手段。中草药作为天然产物在自然界中大多易降解、对非靶标生物毒性低、具有抗病毒、抗菌和抗炎等多种药理活性,是抗病毒药物创新的重要药源库。本研究在黄柏、芸香、柴胡等88种中草药的抗LMBV活性筛选的基础上,对具有显著抗病毒活性的黄柏及其活性成分小檗碱(Berberine,BBR)进行了细胞和个体水平的抗LMBV效果评价;进一步采用流式细胞术、透射电镜和Western blot等检测技术初步探究小檗碱的抗病毒机制,以期为开发新型抗LMBV药物提供理论依据。本研究取得结果如下:1.中草药及活性成分抗LMBV活性研究以88种甲醇提取的中草药粗提物为研究对象,黑头软口鲦上皮瘤细胞系(Epithelioma papulosum cyprinid cells,EPC)为细胞筛选模型,通过RT-q PCR检测LMBV的增殖情况,体外筛选出黄柏、五加皮、知母、苍术、牵牛子、车前草、佩兰和芸香8种中草药对LMBV的抑制率超过90%,其中黄柏的抗LMBV活性最佳,抑制率达到99.9%。进一步采用RT-q PCR方法对黄柏主要成分的抗病毒活性分析发现:小檗碱活性最高,抑制率可达99.75%,其次是木兰花碱,抑制率仅34.28%,其中白藓碱、药根碱、吴茱萸碱和吴茱萸次碱对LMBV均无抑制作用;对小檗碱通过RT-q PCR、病毒滴度检测和细胞病变(Cytopathic effect,CPE)观察研究发现:小檗碱可显著降低病毒滴度并抑制LMBV诱导的细胞病变,其半数抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC_(50))为11.29μM,表明小檗碱具有良好的体外抗LY2835219体外LMBV活性。2.小檗碱通过线粒体凋亡途径抑制LMBV增殖研究以小檗碱为研究对象,通过细胞荧光染色方法检测其对EPC细胞形态保护效果,发现LMBV感染细胞48h后,细胞大量死亡脱落,细胞膜溶解并伴有细胞核碎裂,而小檗碱处理后与对照组细胞膜形态无明显差异,但仍存在一定的细胞核碎裂现象,表明细胞凋亡在小檗碱抗病毒过程中可能具有重要作用。进一步通过流式细胞术对小檗碱处理的细胞凋亡程度进行检测,发现LMBV感染6 h后小檗碱处理组的细胞凋亡率相对病毒组升高了13.73%,表明小檗碱可以有效诱导LMBV感染EPC细胞的凋亡。利用透射电镜观察EPC细胞内部超微结构发现,小檗碱处理感染细胞6 snail medickh后,细胞内部相对于病毒组出现了明显的细胞凋亡特征,如染色质固缩、细胞骨架崩解、胞膜内陷形成小泡等,表明小檗碱在病毒感染早期诱导细胞凋亡,从而抑制LMBV的增殖。进一步采用RT-q PCR、滴度检测和细胞病变观察验证细胞凋亡对LMBV增殖的影响,发现星形孢菌素(Staurosporine)、依托泊苷(Etoposide)和Z-VAD-FMK均可显著抑制LMBV的增殖并减轻细胞形态的损伤,表明细胞凋亡的调控对LMBV增殖具有重要影响。线粒体膜电位检测结果表明,LMBV感染6 h后,小檗碱处理组EPC细胞的线粒体膜电位相对于病毒组显著降低。进一步通过Western blot检测线粒体凋亡途径关键效应蛋白caspase-9和caspase-3的活化,发现LMBV感染6 h后cleaved caspase-9和cleaved caspase-3表达水平与对照组无显著差异,而小檗碱处理感染细胞后cleaved caspase-9和cleaved caspase-3表达水平显著升高,表明小檗碱降低病毒感染细胞线粒体膜电位,激活线粒体凋亡途径。以上结果表明,小檗碱在LMBV感染过INCB018424分子式程中可能通过线粒体凋亡途径抑制LMBV的增殖。3.小檗碱在体抗LMBV活性研究以大口黑鲈为研究对象,通过注射方式研究LMBV感染量与大口黑鲈累计死亡率的相关性,选择10~3 TCID_(50) LMBV为病毒感染剂量。采用注射给药的方式验证小檗碱在体抗LMBV活性,发现3.93 mg/kg小檗碱治疗后大口黑鲈相对病毒组累计死亡率降低了15%,表明小檗碱可以有效提高LMBV感染后大口黑鲈的存活率。通过RT-q PCR方法检测大口黑鲈肝脏、脾脏和肾脏中LMBV的增殖情况,发现大口黑鲈在LMBV感染1 d和4 d时,小檗碱显著地降低肝脾肾组织中72.13-86.23%的病毒表达量,表明小檗碱可以在病毒感染复制高峰期有效抑制LMBV在大口黑鲈肝脾肾组织中的增殖。同时,小檗碱处理后大口黑鲈的病毒滴度相对于病毒感染组显著降低。以上结果表明,小檗碱有效提高了感染LMBV大口黑鲈的存活率并显著降低鱼体内病毒载量,表现出良好的抗病毒效果。综上所述,本研究发现小檗碱在体外和体内均能有效抑制LMBV增殖,降低感染病毒大口黑鲈的死亡率。同时,小檗碱可能通过线粒体凋亡途径抑制病毒增殖。因此,本研究对中草药抗LMBV活性的研究具有重要意义,为抗LMBV新型药物的研发提供了理论依据。