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狼疮性肾炎(lupus nephritis,LN)是系统性红斑狼疮常见且严重影响预后的并发症之一。儿童患者占比更大,早期和长期缓解可有效提高肾生存率。病初,血清中大量致病性自身抗体和免疫复合物可引起包括肾小球内皮细胞(glomerular endothelial cell,GEC)在内的整个内皮系统发生氧化应激,其与免疫反应交互影响,是LN发生的始动因素之一。糖萼是内皮细胞的第一道屏障,主要成份是蛋白聚糖和糖胺聚糖。蛋白聚糖中的多配体聚糖-1(syndecan-1,SDC-1)与糖胺聚糖中的硫酸乙酰肝素(heparin sulfate,HS)相连接,构成糖萼的“骨架”。氧化反应使糖萼脱落,导致患儿血、尿中SDC-1、HS升高。核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2)是氧化应激关键的转录因子,而血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是位于其下游重要的抗氧化酶。丁苯酞(dl-3n-butyphthalide,NBP)可活化Nrf2/HO-1抑制氧化损伤。然而,关于LN患儿GEC的氧化应激病变,血、尿中糖萼损伤后SDC-1、HS的水平及可能机制知之甚少。本课题对LN GEC病理特殊改变、糖萼成份脱落情况、相关损伤及保护机制进行了系列研究。第一部分 弥漫毛细血管内皮细胞增生狼疮性肾炎患儿的临床病理及短期预后目的:探讨儿童LN GEC弥漫增生在临床、病理、早期损伤、诱导治疗及疗效中的意义。方法:收集2012年3月至2021年10月初发初治在河北省儿童医院行肾穿刺活检术诊断LN(Ⅳ型)且于我院随访64例患儿的一般情况、化验报告、肾病理及短期预后资料(随访至少12月或出现死亡终点事件)。根据肾活检病理内皮细胞增生程度分为弥漫性GEC增生(A组)、局灶性GEC增生(B组)及无GEC增生(C组)三组,统计分析各组临床病理指标;根据诱导治疗后6月缓解情况分为完全缓解组及未完全缓解组,进行单因素、多因素分析。结果:64名LN(Ⅳ型)患儿中,A组23例(35.94%)显示存在弥漫性GEC增生。具有住院前病程短,高收缩压、SLEDAI增高,低补体C3、C4,高D-二聚体,SSA、SSB所占百分比低,尿中白细胞、红细胞、尿蛋白定量增高,肾小球滤过率降低的特点(P<0.05)。肾活检病理光镜合并微血栓、基底膜增厚例数增多,洋葱皮比例偏少(P<0.05)。A组有2例患儿诱导治疗期死亡,其余肾脏完全缓解时间明显短于其他两组(P<0.05)。影响诱导6月完全缓解单因素有病初GEC弥漫增生、补体C3、C4、D二聚体、血肌酐、尿红细胞、尿蛋白定量水平及肾小球合并微血栓情况(P<0.05)。多因素分析中弥漫性GAdezmapimod IC50EC增生和尿蛋白定量有统计学意义(P<0.05)。结论:LN患儿病初GEC的弥漫增生在临床、病理及诱导缓解方面与同型非弥漫增生患儿均有差别,应作为相对独立的一种亚型引起足够重视。LN患儿的GEC可能早期就参与到了该病的发病过程中。第二部分 糖萼损伤标志物在狼疮性肾炎患儿血、尿中的表达及可能机制目的:通过检测LN患儿血、尿标本中SDC-1、HS水平的变化及行肾活检LN患儿GEC中Nrf2、HO-1的表达,寻找糖萼脱落敏感标志物并阐明GEC损伤可能机制。方法:2020年10月至2022年10月初发初治于我院住院且治疗6月缓解的系统性红斑狼疮患儿34例资料。根据是否有肾脏受累分为LN组、非LN组。收集临床病理、治疗随访、血和尿标本齐全(治疗前、治疗后6月)且合格的患儿的资料。同期性别年龄匹配的健康患儿10例作为对照组。采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测血、尿标本SDC-1、HS水平,统计组间及治疗前后差异。LN行肾活检患儿18例匹配同期的轻微病变/微小病变患儿10例的病理切片。采用免疫组化法测GEC中Nrf2、HO-1的表达,统计组间差异。结果:治疗前,血、尿标本中SDC-1、HS在LN及非LN组之间无统计学差异(P>0.05),与对照组相比明显升高(P<0.05)。治疗后LN及非LN组血、尿SDC-1、HS两组比较无统计学差异(P>0.05)。LN、非LN两组治疗6月后血、尿SDC-1及HS与治疗前比较明显降低且有统计学差异(P<0.05)。LN组患儿肾病理GEC中Nrf2、HO-1表达明显高于对照组且有统计学意义(P<0.05)。结论:LN患儿发病初期血、尿标本中SDC-1及HS的水平增高,随LN患儿疾病缓解表达减低。糖萼脱落产物SDC-1、HS可作为LN疾病活动及评价治疗效果的标志物。LN患儿GEC损伤可能与Nrf2、HO-1在GEC中的异常表达有关。第三部分 丁苯酞通过激活Nrf2保护细胞糖萼机制研究目的:脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)作用于HK-2细胞建立体外细胞模型,验证NBP能否通过激活Nrf2抑制细胞氧化反应,稳定SDC-1、HS水平,减少糖萼损伤保护细胞。方法:筛选合适的实验LPS浓度、NBP浓度、Nrf2最佳siRNA序列。实验分为HK-2+siRNA NC、HK-2+Nrf2 siRNA、HK-2+siRNA NC+NBP、HK-2+Nrf2 siRNA+NBP、HK-2+LPS、HK-2+LPS+NBP六组。流式细胞检测各组细胞凋亡情况。RT-PCR方法检测Nrf2 mRNA的表达。蛋白印记检测目标蛋白NrfVE-822核磁2、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synth-ase,iNOS)、硫酸肝素蛋白多糖2(heparan sulfate proteoglycan 2,HSPG2)、SDC-1、血栓调节蛋白(thrombomodulin,TM)、血清组织纤溶酶原激活物(tissue plasminogen activator,tPA)的表达;比较各组间差异。结果medical isolation:选择10μg/ml LPS作用于HK-2细胞建立细胞体外模型,100μM为NBP无毒性浓度,Nrf2 siRNA1900敲降效果最佳。转染Nrf2 siRNA显著降低Nrf2 mRNA的表达水平(P<0.05),同时也降低Nrf2、E-cadherin、HSPG2、SDC-1、TM、tPA蛋白的表达水平(P<0.05),显著增加iNOS的表达水平(P<0.05)。加入NBP处理增加Nrf2 mRNA及蛋白的表达水平(P<0.05),同时E-cadherin、HSPG2、SDC-1、TM、tPA蛋白的表达水平也增加(P<0.05),显著降低iNOS的表达水平(P<0.05)。结论:丁苯酞通过激活Nrf2使HK-2细胞体外模型中iNOS蛋白降低,Nrf2、E-cadherin、HSPG2、SDC-1、TM、tPA蛋白表达增加,保护糖萼,减少了细胞的凋亡。

目的 在肝细胞癌(HCC)高危因素背景下，探讨基于钆塞酸二钠(Gd-EOB-DTPA)增强MRAdavosertib纯度I高度异型增生结节(HGDN)分类处理对2018版肝脏影确认细节像报告与数据系统(LI-RADS)诊断效能的影响。方法 回顾性分析2015年1月至2021年12月在桂林医学院附属医院放射科，行Gd-EOB-DTPA增强MRI检查并术后经病理诊断的169例HCC高风险患者，共192个肝结节。两名放射科医师独立评估患者的影像征象，根据2018版LI-RADS分类标准将结节分类，统计分析LR-4/5、LR-5的诊断效能。为HGDN增加一个新分类LR-DN,将病理结果为HGDN的结节分类为LR-DN,其他结节分类不变，重新统计LR-4/5、LR-5的诊断效能。结果 2018版LI-RADS分类LR-4/5、LR-5的灵敏度、特异度、准确率分别为92.81%、56.41%、85.42%和82.35%、79.49%、81.77%。新增LR-DN分类后，LR-4/5、LR-5的灵敏度无变化，特异度分别为87.18%、92.31%,准确率分别为91.67%、84.38%。结论 Gd-EOB-DTPA增强MRI结合2018版LBiogenic resourceI-RADS对小肝癌(sHCC)的诊断效能较高，新增LR-DN分类可以提高LI-RADS分类对sHCC的诊断效能，同时加强临床对HGDN的分类管理、随访及诊疗策略。

食叶草中富含蛋白质,是新型的食用资源。黄酮类化合物具有多种生物健康功效,但因其水溶性差、稳定性低,极大限制了其在食品中的应用。为提高黄酮类化合物的稳定性,本课题以食叶草为材料,采用碱溶酸沉法提取食叶草蛋白,并表征蛋白的理化特性。我们将食叶草蛋白用于包埋四种具有不同酚羟基位置的黄酮类化合物(白杨素、黄芩素、芹菜素和高良姜素),分析不同酚羟基位置的黄酮类化合物与食叶草蛋白的相互作用;然后,构建芹菜素-食叶草蛋白二元复合胶束体系,添加酵母β-葡聚糖,制备芹菜素-食叶草蛋白-酵母β-葡聚糖三元复合胶束,并对三元复合胶束的理化性质、结构性质和相互作用机制进行分析。主要结果如下:1、食叶草蛋白理化性质的分析食叶草中蛋白质含量为35.67%,我们联用碱溶酸沉和透析法分离纯化食叶草蛋白,提取率为44.61%,纯度为82.57%。体积排除色谱法测得蛋白的平均分子量约为44.53 k Da。采用全自动氨基酸分析仪测得食叶草蛋白富含18种氨基酸,其中疏水性氨基酸含量占总氨基酸的45.52%,可为黄酮类化合物提供较好的疏水空腔。2、二元复合胶束的制备与表征我们采用食叶草蛋白包埋四种具有不同酚羟基位置的黄酮类化合物,结果发现,包封效率依次为:芹菜素>高良姜素>黄芩素>白杨素。随着温度的升高,K_(SV)降低,而K_q明显高于最大扩散碰撞猝灭常数2.0×10~(10)L·(mol·s)~(-1),说明食selleck NSC125066叶草蛋白和黄酮类化合物之间发生了静态猝灭。热力学参数?H<0,?S<0,?G<0,表明食叶草蛋白和黄酮类化合物之间的结合是自发吸热过程,氢键和范德华力是自组装的主要驱动力。体外消化实验结果表明,食叶草蛋白对四种黄酮类化合物都具有缓释作用。且贮藏三个月后,黄酮类化合物的保留率都在60%以上,表明食叶草蛋白胶束显著提高了黄酮类化合物的稳定性。3、三元复合胶束的制备与表征在上述基础上,选择包埋效果最佳的芹菜素-食叶草蛋白为代表性二元复合胶束,进一步探究酵母β-葡聚糖对二元胶束的增稳增效作用。结果表明,当酵母β-葡聚糖的添加量为0.5%(w/w)时,芹菜素的包埋率提高至89.23%。在三元复合胶束自组装过程中,酵母β-葡聚糖诱导了食叶草蛋白空间结构展开,使其暴露更多的内源性荧光基团。FT-IR图谱显示,酵母β-葡聚糖与芹菜素-食叶草蛋白复合纳米胶束之间发生了氢键相互作用。热力学参数表明芹菜素-食叶草蛋白-酵母β-葡聚糖三元复合胶束的形成是自发吸热过程,氢键和范德华力是主要驱动力。模拟消化实验结果显示,酵母β-葡聚糖可以有效减缓芹菜素在胃中clinical and genetic heterogeneity降解,并使其在肠道中高效持续释放,有利于发挥芹菜素真实的营养价值和健康功效。综上所述,食叶草蛋白基递送体系对黄酮类化合物具有较好的包埋效果和稳态化作用,且黄酮类化合物的酚羟基结构是调控自组装胶束功能特性的关键。研究结果将对食selleckchem品功能因子递送载体的开发及食叶草蛋白的高值化利用提供理论指导。

C59核磁目的探讨法尼基转移酶抑制剂对野生型KIT及胃肠道间质瘤中常见KIT突变及其下游信号传递的作用。方法采用表达野生型KIT、胃肠道间质瘤中常见的KIT一次突变W557K558del和V560D以及该肿瘤在靶向药物治疗后产生耐药性的KIT二次突变W557K558del/V654A和W557K558del/N822K的Ba/F3细胞作为研究模型,用法尼基转移酶抑制剂Tipifarnib或Lonafarnib处理以上Ba/F3细胞,通过Western blot和免疫沉淀检测KIT及其下游信号分子的活化情况Ahmed glaucoma shunt,用CCK8法检测KIT介导的细胞增殖以及流式细胞术检测细胞凋亡和周期情况。此外,法尼基转移酶抑制剂与KIT抑制剂伊马替尼联合用药作用于以上Ba/F3细胞,通过CCK8法和流式细胞术检测KIT介导的细胞增殖、存活和细胞周期情况。结果法尼基转移酶抑制剂能够抑制胃肠道间质瘤常见的一次突变型KIT和二次突变型KIT介导的ERK活化;法尼基转移酶抑制剂能够抑制野生型KIT、一次突变型KIT和二次突变型KIT介导的细胞存活和增殖,并能诱导细胞周期阻滞;法尼基转移酶抑制剂和KIT抑制剂伊马替尼联合用药时可更大程度地抑制野生型KIT和突变型KIT介导的细胞增殖和存活。结论法尼基转移酶抑制剂可抑制胃肠道间质瘤常见突变型KIT介GSK1120212价格导的ERK活化以及细胞存活和增殖,并能够增强伊马替尼对KIT介导的细胞存活和增殖的抑制作用。

目的：探讨对妊娠期深静脉血栓患者采用低分子肝素治疗的应用价值，观察患者预后情况。方法：选取2021年1月—2022年10月我院收治的50例妊娠期发生深静脉血栓患者为例，随机数字表法将其分成对照组（n=25，常规护理质量）与研究组（n=25，低分子肝素治疗），对比下肢周径差以及下肢深静脉平均血流速、凝血功能相关指标、疼痛评分及肿胀消失时间。结果：研究组与同期对照组相比，大腿周径差与小腿周径差较小，股深静脉与腘静脉平均血流速较慢（P<0.05）；研究组与同期对照组相比，活化部分凝寻找更多血活酶时间、凝血酶原时间、凝血酶时间均较长，纤维蛋白原、D-二聚体以及血小板计数均较低（P<0.05）；研究Microbial biodegradation组与对照组相比，疼痛程度评分较低，肿胀消失时间较短（P<0.05）。结论：在妊娠期深LGX818浓度静脉血栓患者的治疗中采用低分子肝素可改善其凝血指标，缓解临床症状，建议推广并临床广泛应用。

目的 采用网络药理学方法观察天然化合物色胺酮的抗肿瘤药理机制。方法 通过ADMETlab2.0数据库对色胺酮分子的类药性进行评估，运用PharmMapper、SwissTargetPrediction数据库预测色胺酮的作用靶点，借助OMIM数据库、DisGeNET数据库收集肿瘤疾病靶点，筛选出色胺酮抗肿瘤作用潜在蛋白靶点。利用STRING数据库、Cytoscape3.7软件依次构建蛋白靶点之间的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络、“化合物-靶点-通路-疾病”网络；基于DAVID数据库进行GO功能富集分析、KEGG通路富集分析。采用AutodockVina1.1.2进行分子对接，分析色胺酮与筛选出的核心靶点蛋白之间相互作用。借助现有临床肿瘤数据库，对核心靶点开展基因表达谱交互分GDC-0973体外析。结果 通过网络药理学研究共获得色胺酮抗肿瘤核心靶点153-MA临床试验8个，GO功能富集分析的生物过程与炎症反应、蛋白质磷酸化、细胞内信号转导等关联，细胞组成与胞浆、细胞质、高分子复合物等较为密切，分子功能与MAPK酶活性、ATP绑定、酶结合等相关。KEGG通路富集分析表明癌症的途径、PI3K-AKT信号通路等是色胺酮发挥抗肿瘤的主要途径，涉及核心靶点AKT1、PI3K、MAPK1、HSP90AA1、JAK2、NFKB1等。High-Throughput色胺酮与5种核心靶点AKT1、HSP90AA1、PI3K、JAK2、MAPK1之间有较好的结合活性，结合能均不超过-8.6kcal·mol~(-1)。色胺酮抗肿瘤核心靶点的基因表达谱交互分析结果显示上述5种核心蛋白靶点均在人类肿瘤疾病发生发展中扮演重要作用。结论色胺酮通过PI3K-AKT等信号通路发挥抗肿瘤作用。

目的 观察阿扎胞苷联合维奈克拉在地西他滨治疗失败骨髓增生异常综合征中的应用效果。方法 10例地西他滨治疗失败的骨髓增生异常综合征患者，采用阿扎胞苷联合维奈克拉治疗：阿扎胞苷75 mg/m2皮下注射7d，每28天为一个疗程，阿扎胞苷治疗同时开始口服维奈克拉400 mg (1次/日)，最少14 d。随访并判定疗效，分别于治疗前、后抽取患者骨髓3 mL检测25个MDS常见突变基因后测算等位基因突变频率VAF(Variant allele fraction,VAF)，观察并记录治疗中不良事件发生情况。结果 10例患者用维奈克拉联合阿扎胞苷治疗1～6个周期，中位治疗2.5个周期，治疗后ORR 5例、CR 2例、CRi 1例、PR 1例及NR 1例。与治疗前比较，治疗后10例患者VAF降低（P均<0.5。10例患者治疗过程中不良事件为血小板水平降低17例次、肺部感染11例次、电解质紊乱20例次及胃肠道症状15例次等。10例患者中肺部感染死亡1例、脑出血死亡1例。结论 阿扎胞苷联合维奈克拉用于地西他滨治new anti-infectious agents疗失败的骨髓增生异常综selleck化学合征患者效果较好，可有效降低患者等位基因突变频率R428 IC50，改善患者预后，但易发生不良事件。

目的：探究千金子二萜醇调控TGF-β/Smad信号转导通路影响肾癌小鼠免疫因子IL-7、IL-10及VEGF表达的机制。方法：构建肾癌移植瘤小鼠，随机划分为模型（Model）组、此网站千金子二萜醇（Euphorbia Lathyrol）组和顺铂（Cisplatin）组，Euphorbia Laneurogenetic diseasesthyrol组给予20mg/kg Euphorbia Lathyrol溶液灌胃，Model组给予等体积0.9% NaCl溶液灌胃，Cisplatin组给予腹腔INCB28060注射4m/kg顺铂溶液，记录小鼠体重及瘤块体积变化；Western blot检测TGF-β1、Smad2和Smad4蛋白表达；ELISA检测小鼠血清免疫因子IL-7和IL-10表达；IHC检测瘤块组织VEGF表达。结果：药物干预14天后，与Model组相比，Cisplatin组和Euphorbia Lathyrol组抑制小鼠移植瘤体积增殖（P<0.05），TGF-β1、Smad2、Smad4蛋白及VEGF表达降低（P<0.05），血清中IL-7表达增加、IL-10水平降低（P<0.05）。结论：千金子二萜醇能够抑制TGF-β1/Smad信号转导通路进而降低肾癌小鼠IL-7、IL-10及VEGF表达。

胃食管结合部癌是上消化道常见的恶性肿瘤之一,其发病率在世界范围内呈上升趋势。手术切除结合辅助化疗是胃食管结合部癌常用治疗策略。但是,术后复发的可能性较高,中晚期患者治疗后五年生存率仅为20%左右。预后较差。目前,一般把发生于胃食管交界线上下5cm区域以内的癌,称之为胃食管结合部癌。因其特有的解剖学、织学特点和临床表现,一般分为早期和进展期癌。早诊早治是目前综合防治胃食管结合部癌的主要措施。内镜检查是我国胃食管结合部癌使用最广泛的筛查手段。但是内镜检查存在效率低等缺点,不适合大范围人群中推广筛查。近年来,基于蛋白组学技术探索肿瘤发生发展机制,筛选肿瘤标志物,进行分子分型的研究逐渐增多,比如食管癌,胃癌,肝癌等等,然而针对胃食管结合部癌尤其是胃食管结合部癌前病变组学研究仍属空白,亟待建立胃-食管结合部病变发展阶段分子差异全景图,促进有效诊断标志物及药物靶点的发掘。然而,可长期稳定传代的肿瘤相关模型的缺少对胃食管结合部癌的研究造成了阻碍,类器官是具有器官特异性细胞组成的关键结构和功能特性培养物,能够部分甚至完全还原体内器官的细胞构成和结构功能,可以克服传统细胞系或动物模型无法模拟体内的肿瘤微环境限制。目前,已被广泛用于药物筛选、药物安全性测试、预测患者治疗反应。因此,本研究通过构建类器官来模拟体内的免疫微环境为后期研究提供重要的工具。总之,本研究利用基于质谱的蛋白质组学技术,绘制了胃食管结合部癌和癌前病变组织特异性的蛋白质组学图谱,筛选了PLOD3和CACYBP作为胃食管结合部早期癌变的候选标志物,CDK4作为胃食管结合部癌发生发展过程中的关键蛋白,为胃食管结合部癌的早诊早治提供重要的实验依据。第一部胃-食管结合部癌及癌前病变组织的蛋白质组研究及生物信息学分析目的:本研究旨在构建胃-食管结合部(Esophagogastric junction,EGJ)癌和癌前病变组织的特征性蛋白质组学图谱,探讨胃-食管结合部癌进展过程中的分子机制。方法:1.应用质谱分析技术筛选50对胃-食管结合部癌和50对癌前病变组织,及对应非病变组织中的蛋白质组的差异。2.应用加权基因共表达网络等生物信息学方法分析胃-食管结合部癌进展过程中差异表达的蛋白与临床病理信息之间的相关性。结果:1.蛋白质组学研究结果显示,在胃-食管结合部癌组织和癌前病变组织中共鉴定出9192个具有独特肽段的蛋白质,以差异倍数超过1.5,P<0.05,作为显著上调的变化阈值,与对应非病变组织相比,胃-食管结合部癌前病变组织中1121个蛋白上调,858个蛋白下调;与癌旁组织相比,胃-食管结合部癌组织中1442个差异蛋白上调,1093个蛋白下调。2.加权基因共表达网络分析结果显示,胃-食管结合部癌进展过程共分为9个蛋白模块,其中,蓝色和青色模块与临床病理信息密切相关。小结:本实验成功构建胃-食管结合部癌和癌前病变组织的特征性蛋白质组学谱图。并基于加权基因共表达网络分析聚类到9个与胃-食管结合部癌进展相关的蛋白模块。第二部分CACYBP、PLOD3和CDK4在胃-食管结合部癌和癌前病变组织中的表达及作为潜在标志物的初步研究目的:筛选胃-食管结合部癌潜在标志物,探讨其作为胃-食管结合部癌候选标志物的灵敏度和特异度。方法:1.应用受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve,简称ROC曲线)筛选早期胃-食管结合部癌的候选标志物。2.应用蛋白互作网络分析筛选参与胃-食管结合部癌发生发展中的关键蛋白。3.应用免疫组织化学技术验证PLOD3、CACYBP和CDK4在胃-食管结合部炎症、癌前和癌组织中的表达。4.应用TCGA、TIMER等多种数据库分析CDK4、CACYBP和PLOD3与免疫微环境的相关性。结果:1.ROC结果显示,PLOD3和CACYBP能明显区分非病变与病变组织,PLOD3和CACYBP联合应用有助于胃-食管结合部癌的早期诊断。2.蛋白互作网络分析结果显示,CDK1、CDK2、CDK4、LRRK2、ERBB2、MAPK13在胃-食管结合部癌变过程中显著升高,并且处于Hub网络核心位置。3.免疫组织化学染色实验结果显示,PLOD3、CACYBP在癌变组织中的表达高于对应非病变组织,阳性表达部位在肿瘤细胞的胞浆中。CDK4在胃-食管结合部癌和癌前病变组织中高表达,阳性表达部位在肿瘤细胞的胞核或胞浆中。4.TCGA、TIMER等数据库分析显示,CDK4的表达与肿瘤微环境中的CD4+T(CDR=-0.171,P=1.00e-03)细胞和B细胞(CDR=-0.367,P=3.47e-13)的浸润水平呈显著负相关关系;PLOD3的表达与B细胞(CDR=-0.176,P=7.06e-04),CD8+T细胞(CDR=-0.175,P=7.46e-04),巨噬细胞(CDR=-0.197,P=1.32e-04),中性粒细胞(CDR=-0.164,Preduce medicinal waste=1.49e-03),树突状细胞(CDR=-0.182,P=4.27e-04)的浸润水平呈显著负相关关系;CACYBP的表达与B细胞(CDR=-0.216,P=2.79e-05),CD4+T细胞(CDR=-0.26Ferrostatin-1体外6,P=2.35e-07),巨噬细胞(CDR=-0.17,P=1.04e-03)的浸润水平呈显著负相关关系。小结:PLOD3和CACYBP的联合应用有助于区分胃-食管结合部早期病变患者和健康人群。CDK4是胃-食管结合部癌发生发展中的关键蛋白。第三部分基于类器官(Patient Derived Organoid,PDO)细胞模型进行药物靶点研究目的:构建胃-食管结合部癌组织PDO细胞模型进行药物筛选。方法:1.应用组织块法和酶消化法构建6株p38 MAPK抑制剂胃-食管结合部癌组织PDO细胞模型,并进行传代培养。2.应用Western blot实验检测CDK4在6株胃-食管结合部癌PDO细胞模型中的表达。3.应用MTS细胞增殖实验,验证CDK4/6抑制剂帕博西尼(Palbociclib)对胃-食管结合部癌组织PDO细胞模型增殖的影响,并分析其IC50值与CDK4蛋白表达的关系。结果:1.本次实验成功构建6株胃-食管结合部癌组织PDO细胞模型,6株类器官均呈囊泡状结构,由单层上皮构成,上皮细胞间呈平行方向无规则排列。2.Western blot实验结果显示,CDK4在胃食管结合部癌细胞中高表达。3.药物敏感性实验结果显示,帕博西尼(Palbociclib)能够明显抑制PDO细胞增殖。并且CDK4的表达量与帕博西尼的IC50值呈负相关关系(相关系数为0.9678,p值为0.0004)小结:本研究成功构建6株胃-食管结合部癌组织PDO细胞模型,帕博西尼可显著抑制胃-食管结合部癌PDO模型细胞的增殖,且CDK4表达量与帕博西尼的敏感性呈正相关关系。结论:本研究基于4D label free蛋白质组学技术,首次绘制了胃-食管结合部癌和癌前病变组织的特征性蛋白质组学图谱,为揭示胃-食管结合部癌动态演进分子机制提供了契机。PLOD3和CACYBP的联合诊断有助于早期胃-食管结合部癌的筛查。帕博西尼作为一类CDK4/6抑制剂,能够明显抑制胃-食管结合部癌类器官细胞的增殖。

大白菜(Brassica rapa L.ssp.pekinensis)是东亚国家和地区普遍栽培的蔬菜作物,叶片是其光合作用器官和主要的产品器官,叶片宽窄影响叶球形成与发育,叶片皱缩影响光能利用与光合作用,叶片衰老会影响其产品的产量和质量,因此,叶片形态与发育研究历来受到研究者重视。本人所在团队利用0.8%EMS水溶液诱变大白菜双单倍体纯系(DH系)‘FT’的萌动种子,创建了一个包含718份稳定遗传突变材料的突变体库。本研究从中选取窄叶lhd、皱叶lcm和早衰pls等3种叶片发育突变体,在对其突变性状遗传特性分析的基础上,利用Mut Map/BSA-Seq基因定位方法,结合KASP基因分型验证,定位和克隆了突变基因,通过等位变异分析/拟南芥遗传转化实验验证了候选基因的功能。主要研究结果如下:1.克隆了大白菜ANGUSTIFOLIA基因Br AN,利用等位变异验证了其调控大白菜结球的功能利用从结球白菜EMS突变体库中筛选到的窄叶不结球突变体lhd1和lhd2为试材,首先分别与野生型杂交获得F_1,再用两个F_1杂交,证明了两者的突变性状属于等位变异,由单隐性核基因控制。采用Mut Map基因定位方法和KASP基因分型验证,预测Bra A10g000480.3C为候选基因。该基因编码C端结合蛋白ANGUSTIFOLIA,参与细胞在叶宽方向的扩展,将其命名为Br AN。候选基因克隆测序结果表明,突变体lhd1的Br AN第2内含子的第1个碱基发生了由G→A的碱基替换,导致98 bp的第2内含子序列保nonsense-mediated mRNA decay留在CDS序列中,保留序列中含一个TGA终止密码子,造成蛋白质翻译提前终止;突变体lhd2的Br AN第4外显子的第1855个碱基上发生了由G→A的碱基替换,导致形成终止密码子TAG,使蛋白质翻译提前终止。上述两个等位变异的序列分析结果,验证了窄叶不结球性状是由Br AN突变造成的。2.通过拟南芥异源转化实验,验证了Br AN通过调控微管排列影响细胞扩展方向调节大白菜叶片宽度利用Br AN启动子分别与‘FT’中的Br AN和lhd1中Bran构建重组载体,异源转化拟南芥突变体an-t1,证明了大白菜野生型Br AN可以恢复拟南芥突变体的窄叶表型,但突变基因Bran未能恢复。利用激光共聚焦显微镜观察拟南芥的细胞形态和微管排列,发现野生型铺板细胞呈拼图状,细胞内微管随机排列;突变体铺板细胞形状更加规则,宽度较窄,微管排列平行于叶宽方向。Br AN恢复了拟南芥突变体异常的细胞形态和微管排列,而Bran未能恢复。上述结果验证了Br AN通过调控微管排列方式,影响细胞在叶宽方向扩展来调节叶片宽度。3.利用BSA-Seq基因定位方法结合KASP基因分型验证,定位了大白菜皱叶基因Br SCRM皱叶突变体lcm株型矮小,叶片皱缩。遗传分析证明了其突变性状由一对不完全显性核基因控制。利用BSA-Seq基因定位方法,结合KASP基因分型验证,预测Bra A06g038100.3C为候选基因。该基因编码转录因子SCRM,调节气孔发育,将其命名为Br SCRM。克隆测序结果表明,在Br SCRM第1外显子上发生了由G→A的碱基替换,导致所在密码子由精氨酸变成组氨酸。Br SCRM在野生型‘FT’的各个器官中均有表达。亚细胞定位结果表明,Br SCRM位于细胞核中。4.通过拟南芥异源转化实验,验证了Br SCRM突变造成叶片气孔数目激增影响大白菜叶片扩展细胞学观察表明,与野生型相比,叶片皱缩突变体的叶表气孔密度明显增大,突变体与野生型杂交的F_1叶表气孔密度介于两亲本之间。将突变体的Brscrm转入拟南芥野生型中,转基因植株叶表气孔密度显著增大,且叶片皱缩、卷曲,这一结果证明了突变体气孔过度发育影响叶片扩展,与植株叶片皱缩有密切关系。5.克隆了大白菜早衰基因Br SRFR1,通过等位突变体序列变异分析验证了其功能大白菜结球后期,外叶逐渐衰老变黄。但是,早衰突变体pls1和pls2的叶片在结球初期即表现出衰老症状。遗传分析证明了pls1和pls2的早衰性状均由隐性核基因控制。杂交实验证明了突变性状属于等位变异。采用Mut Map基因定位方法和KASP基因分型验证,预测Bra A01g001400.3C为候选基因,该基因编码一个含四肽重复结构域的蛋白SRFR1,参与免疫反应调控,将其命名为Br SRFR1。克隆测序结果表明,突变体pls1的Br SRFR1第7外显子上发生了由C→T的碱基替换,导致形成终止密码子TGA;突变体pls2的Br SRFR1第16外显子上发生了G→A碱基替换,也导致形成终止密码子TGA。6.首次发现了大白菜免疫调节因子Br SRFR1负调控叶片早衰At SRFR1在拟南芥中属于免疫接头蛋白,负调控免疫反应。在RLD生态型的拟南芥中,At SSCH727965 IC50RFR1突变可增强植株对甜菜夜蛾的抗性。本研究抗虫实验结果表明,突变体对甜菜夜蛾的抗性显著高于野生型,验证了其在免疫调节中的负作用。突变体叶片的衰老时期较CP-456773野生型明显提前,叶绿体提早解体,叶绿素含量显著降低。Br SRFR1的表达量随叶片生长发育逐渐增加,在结球晚期达到最高。转录组测序结果表明,多个衰老相关基因在突变体中上调表达,大量光合作用相关基因下调表达,多个茉莉酸(JA)和水杨酸(SA)信号转导途径中的关键基因在野生型和突变体中差异表达,突变体叶片中茉莉酸和水杨酸含量显著高于野生型,说明突变体的早衰性状可能与茉莉酸和水杨酸合成与信号转导有关。