背景:不孕不育已成为影响人类生活和Cholestasis intrahepatic健康的新型疾病,在全球范围内不孕症发病率约为8-15%,其中男性因素约占50%。男性不育通常非单一因素导致,可能由多个因素协同作用或者多种疾病共同效应产生。男性不育表型具有极大的异质性,其中非梗阻性无精症是男性不育疾病谱中较为严重的表型。随着对男性生殖细胞生物学的深入理解以及对精子发生过程涉及的大量睾丸特异性基因的认识,考虑男性不育很大部分可能为遗传起PEG300分子式源。目的:1.基于男性不育家系的临床遗传学分析确定特定表型的高度候选致病基因及变异;2.构建候选基因人源化小鼠模型评估候选基因在雄性小鼠生殖功能中的作用及候选基因变异对雄性生育力的危害,探索产生候选基因变异导致雄性不育的分子机制;3.通过挖掘公共数据平台小鼠睾丸单细胞数据探索候选基因损害男性生育力的分子机制,构建候选基因表达质粒通过体外功能实验来观察候选变异对蛋白质稳定性及细胞功能的影响。方法:1.纳入1个罕见的男性不育家系,该家系中两位先证者均诊断为非梗阻性无精症,通过全外显子组测序及严格的变异筛选流程获得初步候选基因及变异,在人类蛋白质数据库及小鼠基因组数据库对候选基因进行进一步过滤得到优先级候选变异,并进行Sanger测序验证及家系共分离分析;2.应用CRISPR/Cas9技术构建候选基因敲除及候选基因变异敲入小鼠,通过生育力测试实验、产仔数、附睾精子计数、睾丸组织切片、透射电镜以及蛋白质印记等实验确定基因编辑小鼠生育表型、精子超微结构变化及可能的分子机制;3.应用新的分析方法挖掘公共数据库中Akap4敲除小鼠睾丸单细胞转录组数据,通过差异表达基因分析、RNA速率分析、拟时序分析等评估Akap4缺失对各级生殖细胞发育的影响,并通过富集分析及PPI分析探索Akap4缺失损害精子发生的分子机制;4.通过构建AKAP4过表达质粒,并生成AKAP4错义突变质粒,观察氨基酸改变对蛋白质稳定性影响及对细胞增殖、凋亡等细胞功能的影响。结果:1.在纳入的非梗阻性无精家系中识别到AKAP4半合子错义突变(NM_003886.2:c.1286G>A;p.Arg429His)并作为该家系的候选变异,但不能排除ZNF282复合杂合错义突变(NM_003575.2:c.904G>A;p.Gly302Ser/c.224C>T;p.Pro75Leu);2.成功构建ZNF282的小鼠同源基因Zfp282基因敲除小鼠,Zfp282敲除的雄性小鼠精子显示出正常生育力及正常的精子发生,推测ZNF282变异影响男性生育力的可能性极低;3.Akap4基因同源点突变小鼠(Akap4R428H)交配生育实验显示与Akp4R428H雄性小鼠交配的雌性小鼠妊娠率显著低于野生型小鼠(33.33%vs 96.00%),每窝产仔数显著降低(8.46 vs 4.63);4.Akap4R428H雄性小鼠睾丸组织切片显示具有正常的精子发生,但与野生型小鼠相比其附睾精子数量下降(1.35 vs 1.84 ×107),精子活动性显著降低(57%vs 84%),精子呈现短尾、卷尾畸形,Akap4R428H雄性小鼠精子超微结构显示鞭毛主段纤维鞘发育不良;5.Akap4R428H雄性小鼠睾丸中Akap4蛋白量显著下降,GSI-IX化学结构同时Akap3及Qrich2蛋白量下降;6.Akap4敲除小鼠睾丸单细胞转录组数据挖掘显示Akap4缺失导致睾丸细胞广泛的转录组改变,RNA速率分析发现Akap4缺失导致单倍体精子细胞中RNA积累速度下降,拟时序分析发现圆形精子细胞发育状态发生改变,延长精子细胞差异表达基因显著富集于精子发生通路,PPI分析构建了以Akap4及H1fnt为核心的精子发生障碍蛋白互作网络;7.293T细胞体外实验发现AKAP4p.R429H导致AKAP4蛋白质稳定性下降,并且该突变导致293T细胞增殖活性下降,凋亡水平增加。结论:1.在非梗阻性无精症患者的家系中鉴定出X连锁AKAP4半合子致病性变异(NM_003886.2:c.1286G>A;p.R429H);2.同源Akap4点突变小鼠呈现雄性生育力下降及精子鞭毛纤维鞘发育不良,证实该错义突变通过功能丧失机制导致男性生育力下降;3.在小鼠中Akap4缺失导致减数分裂后单倍体精子细胞转录水平广泛的变化;4.AKAP4p.R429H变异导致AKAP4蛋白质稳定性下降,并导致293T细胞增殖活性下降及凋亡水平升高。