研究目的目前,肥胖已经发展为世界范围内的流行病ICI 46474 IC50,包括2型糖尿病、心脑血管疾病和肌肉骨骼类疾病。流行病学数据显示,肥胖患者及肥胖兼AMG510试剂二型糖尿病患者常伴有骨密度下降、骨质疏松、骨髓脂肪组织(Bone Marrow Adipose Tissue,BMAT)过度扩增等问题。与一般的脂肪组织(棕色脂肪组织、白色脂肪组织)不同,BMAT位于骨髓腔内。其功能包括调节骨量、造血功能、代谢稳态和骨重塑等。研究表明,运动可以提高肥胖患者的骨密度,并且减少过量的BMAT。然而,运动调节骨髓微环境的机制尚不清楚。本研究旨在探讨运动如何诱导肥胖雄性小鼠的骨髓重塑。我们通过高脂饮食(High Fat Diet,HFD)诱导建立肥胖小鼠模型,并采用转录组测序技术(RNA Sequencing,RNA-Seq)技术全面研究运动对雄性肥胖小鼠骨髓微环境的影响。同时,我们通过分离骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)并模拟体外运动,探讨运动对骨髓间充质干细胞的调节作用。本研究以期为运动治疗肥胖和糖尿病提供新的策略,并减少骨质疏松类并发症的可能。研究方法1.动物研究购买8周龄雄性C57BL/6小鼠。待小鼠适应期过后,对小鼠进行HFD喂养6周以诱导肥胖模型。随后将肥胖小鼠随机分为2组:肥胖组(Obesity group,Ob n=9)和肥胖联合运动组(Obesity+Exercise group,Ob+Exe n=9)。运动组每天以中等强度进行1小时跑台运动,每周6天,并持续12周。肥胖组除喂食HFD外无其他干预措施。每周通过核磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)测量身体成分。在第十二周开始时,对小鼠进行胰岛素耐量实验(Insulin Tolerance Test,ITT)以及葡萄糖耐量实验(Glucose Tolerance Test,GTT)。2.骨骼处理与分析将股骨分离固定后,使用微型计算机断层扫描(Computed Tomography,CT)进行骨密度定量。扫描后重建股骨远端生长板附近的皮质骨和小梁骨结构。使用锇酸染色法对另一侧股骨BMAT进行染色,使用CT扫描重建BMAT并定量。3.骨髓处理与分析分离胫骨骨髓,使用RNA-seq技术检测运动前后骨髓组织全基因组的变化。使用实时荧光定量PCR(Real-time qpcr,RT-PCR)检测骨髓组织中部分骨代谢相关基因的表达水平;使用Western Blot检测降脂蛋白(Adipsin)及骨代谢相关蛋白含量。4.BMSCs的培养与处理从胫骨中分离BMSCs,待细胞密度达到70-90%后将BMSCs传代。收集第二代或第三代细胞,在6孔牵拉板中使用成熟脂肪诱导分化培养基诱导BMSCsarterial infection向脂肪细胞分化。同时,将所有细胞均分为对照组(Control,n=4)和牵拉组(Stretch,n=4),对照组除牵拉外其他条件与牵拉组保持一致。采用Flexcell FX-5000牵拉系统模拟体外运动。牵拉结束后收集细胞进一步分析。研究结果1.肥胖小鼠12周有氧运动改善体成分及胰岛素抵抗肥胖小鼠经12周中等强度跑台运动干预后,在HFD喂养条件下,Ob+Exe组小鼠的体重与脂肪含量均显著低于Ob组(p<0.01),瘦体重则无明显差异。ITT结果显示,在60min时间点时Ob+Exe组小鼠血糖浓度显著低于Ob组小鼠(p<0.05)。并且Ob+Exe组的ITT曲线下面积显著低于Ob组(p<0.05)。2.肥胖小鼠12周有氧运动提高骨密度12周中等强度跑台运动结束后,CT定量分析结果显示,Ob+Exe组小鼠股骨骨小梁的骨表面积、骨体积和平均密度指标均显著高于Ob组(p<0.05)。3.12周有氧运动抑制肥胖小鼠BMAT过度扩增12周中等强度跑台运动结束后,BMAT的CT定量分析结果显示,Ob+Exe组小鼠BMAT体积相比于Ob组小鼠下降28%。4.12周有氧运动显著抑制肥胖小鼠骨髓中Adipsin与Spp1的表达骨髓组织RT-PCR结果表明,相对于Ob组小鼠,Ob+Exe组小鼠成骨细胞相关因子Atf4、Sparc运动后m RNA表达水平显著上调(p<0.05),Ob+Exe组破骨细胞相关因子Rankl、Spp1显著下调(p<0.05)。骨髓组织Western blot结果显示,相对于Ob组小鼠,Ob+Exe组小鼠Alp蛋白水平显著上调(p<0.01),而Spp1与Adipsin蛋白水平在运动后显著下调(p<0.01)。5.12周有氧运动通过机械感应机制改善肥胖小鼠骨髓微环境骨髓组织RNA-seq结果显示,与Ob组相比,Ob+Exe组ECM-receptor interaction(细胞外基质Extracellular matrix,ECM)、Focal adhesions通路被显著抑制(p<0.01)。同时RNA-seq分析结果显示Ob+Exe组小鼠骨重塑相关因子Spp1相对于Ob组小鼠显著下降(p<0.001),此外结果显示Spp1富集在ECM-receptor interaction、Focal adhesion以及PI3K-Akt信号通路中。同时通过HINT数据库检索发现,脂肪因子Adipsin与Spp1存在蛋白质-蛋白质相互作用。6.机械牵拉抑制BMSCs向成熟脂肪细胞分化BMSCs的RT-PCR结果显示,Stretch组Pparg1与Pparg2在机械牵拉后m RNA表达水平显著降低(p<0.05)。BMSCs的Western blot结果显示,相对于Control组,Stretch组Adipsin蛋白表达水平显著降低(p<0.01)。研究结论1.有氧运动延缓肥胖小鼠体重增长,改善肥胖小鼠胰岛素抵抗。2.有氧运动提高肥胖小鼠骨密度(Bone Mineral Density,BMD),抑制肥胖小鼠BMAT过度扩增,改善肥胖小鼠骨髓微环境。3.有氧运动通过机械感应机制重塑骨髓微环境,并可能通过Adipsin-Spp1轴调控肥胖小鼠骨组织与脂肪组织的动态平衡。4.机械牵拉刺激抑制BMSCs分化为成熟脂肪细胞。