宫颈癌是常见的女性生殖系统恶性肿瘤,据全球癌症报告显示,宫颈癌在女性中发病率及肿瘤致死率均位居第四。高危型人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus,HPV)的持续性感染被认为是宫颈癌的主要致病原因,但其确切分子机制仍不清楚。因此,寻找与宫颈癌发生发展相关的分子及治疗靶点,进一步提高患者的生存率,是我们亟待解决的问题。Rac-GTP 酶激活蛋白 1(Rac GTPase Activating Protein 1,RacGAP1)作为RhoGTP酶活性蛋白之一,可与Rho家族的GTP限制性小G蛋白反应,使Rho蛋白恢复到与GDP结合的非活性状态,调节Rac1和Cdc42蛋白,驱动肿瘤生长。研究已发现RacGAP1在乳腺癌等多种肿瘤中高表达,并与不良预后相关。但其在宫颈癌中的作用尚不明确。本研究旨在分析宫颈癌中RacGAP1的表达情况及其对宫颈癌细胞增殖,侵袭、迁移等恶性生物学行为的影响,并探讨其可能的作用机制,以期能够为宫颈癌的治疗提供新的思路和靶点。第一部分宫颈癌发生发展相关基因的筛选及RacGAP1在宫颈癌中的表达目的:通过生物信息学分析,探索宫颈癌发生发展的相关基因;探究RacGAP1表达与宫颈癌患者临床病理特征及预后的关系。方法:利用生物信息学方法筛选宫颈癌发生发展的关键基因。进一步采用qRT-PCR、Western blot及免疫荧光染色检测新鲜宫颈癌组织及细胞系中RacGAP1的表达情况及表达位置;免疫组织化学方法检测RacGAP1和Ki67在宫颈癌组织中的表达,并分析RacGAP1的表达与宫颈癌患者临床病理特征及预后的关系。结果:1Bucladesine NMR.RacGAP1和CDK1是PPI网络的中心基因和不同数据集重叠基因的共有差异基因。2.RacGAP1在宫颈癌中表达升高,其在细胞核和细胞质中均可表达。3.RacGAP1的表达与宫颈癌的组织病理学分级(p<0.001)相关;Ki-67的表达与RacGAP1呈正相关(R=0.51,p=4.6e-10)。4.RacGAP1高表达患者较低表达患者,OS和PFS明显缩短。Ki67的表达与患者的OS和PFS无相关性。RacGAP1的表达是评价宫颈癌预后的独立因素(p<0.05)。小结:1.RacGAP1可能是宫颈癌发生发展的关键基因。2.RacGAP1在宫颈癌组织中表达升高,是宫颈癌不良预后的独立危险因素。第二部分RacGAP1通过miR-192影响人宫颈癌细胞恶性生物学行为目的:探究RacGAP1对人宫颈购买Ipatasertib癌细胞系增殖、侵袭、迁移及细胞周期分布的影响并筛选下游miRNA。方法:利用活性RhoA检测试剂盒检测RacGAP1对Rho活性的影响。CCK-8和克隆形成法检测HeLa、CaSki和SiHa细胞的增殖能力。通过慢病毒感染,构建RacGAP1稳定上调或下调的宫颈癌细胞系。细胞功能实验检测RacGAP1对宫颈癌细胞系体外增殖、侵袭和迁移能力的影响;流式细胞术检测RacGAP1对细胞周期分布的影响。通过裸鼠荷瘤实验检测RacGAP1表达对宫颈癌细胞系体内增殖能力的影响;利用TCGA数据库筛选RacGAP1的下游差异表达的miRNA。利用qRT-PCR、Western Blot和RIP法探究RacGAP1与miR-192之间的关系。细胞功能实验检测miR-192对宫颈癌生物学行为的影响。挽救实验检测miR-192对RacGAP1改变后细胞功能的影响。结果:1.HeLa、CaSki和SiHa的增殖能力依次减弱。2.下调RacGAP1,活性RhoA表达下降;上调RacGAP1,活性RhoA表达增加。3.敲低RacGAP1可导致宫颈癌细胞系增殖功能减弱,阻滞细胞周期进展(p<0.05)。而过表达RacGAP1结果相反(p<0.05)。裸鼠荷瘤实验证明,敲低RacGAP1后细胞的成瘤能力明显下降。4.下调RacGAP1的表达后,宫颈癌细胞的侵袭和迁移功能明显减弱(p<0.05),而过表达Rserum biochemical changesacGAP1可增强宫颈癌细胞的侵袭和迁移功能(p<0.05)。5.miR-192与RacGAP1的表达呈负相关(R=-0.26,p=5.7e-6),高表达miR-192的宫颈癌患者总生存时间更长(p=0.028,Log-Rank检验)。RacGAP1通过TP53调控miR-192;上调miR-192的表达可以减弱增殖,迁移和侵袭能力(p<0.05),而下调miR-192结果相反(p<0.05)。6.下调miR-192可以部分逆转RacGAP1下调所导致的宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的减弱(p<0.05)。反之,上调miR-192可以部分逆转RacGAP1上调所导致的宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的增强(p<0.05)。小结:1.RacGAP1促进宫颈癌细胞增殖,周期进展,侵袭和迁移能力2.宫颈癌中,RacGAP1通过抑制miR-192促进宫颈癌的恶性生物学行为。第三部分RacGAP1通过miR-192及p-JNK调节AP-1的表达及稳定性目的:结合生物信息学分析及分子生物学实验,探索RacGAP1可能的作用机制。方法:基因表达谱分析筛选RacGAP1下游基因,结合GSE108422数据集筛选通路;Western blot及免疫组化验证相关蛋白的变化情况。对miR-192的靶基因和GSE69990数据集的差异基因进行KEGG富集分析。Western blot检测改变miR-192表达对下游基因表达的影响。Western Blot检测挽救实验中相关蛋白的变化。SP600125处理细胞,克隆形成实验检测其对细胞增殖的影响;挽救实验检测SP600125对RacGAP1改变后细胞增殖的影响。Western blot检测相关蛋白的变化情况。结果:1.生信分析及Western blot结果显示RacGAP1通过MKK/JNK通路调节c-Jun的磷酸化,进而影响下游蛋白变化。2.生信分析及Western blot结果显示miR-192影响c-Jun的表达,进而影响下游基因的变化。miR-192可以部分逆转RacGAP1变化导致的下游蛋白变化。3.SP600125抑制细胞增殖。qRT-PCR及Western Blot检测发现SP600125处理后,miR-192、RacGAP1 和 c-Jun 的表达无明显变化而 p-c-Jun,c-Myc,c-Met 的表达下调(p<0.05)。小结:1.RacGAP1可以通过MKK/JNK信号通路影响宫颈癌细胞的生物学行为。2.RacGAP1可以通过miR-192影响c-Jun的表达,通过p-JNK影响c-Jun的磷酸化,进而影响AP-1的形成和活性,从而改变下游基因的表达。。结论1.RacGAP1在宫颈癌组织中表达升高,且与宫颈癌的不良预后相关。2.RacGAP1促进宫颈癌细胞的增殖,细胞周期进程,迁移和侵袭。3.RacGAP1可以通过miR-192影响c-Jun的表达,通过p-JNK影响c-Jun的磷酸化,进而影响AP-1的表达和稳定性,从而改变下游基因的表达,影响宫颈癌的恶性生物学行为。