研究背景胰腺癌是生存率极低的消化系统恶性肿瘤。虽然手术作为胰腺癌患者的根治性治疗手段,但是大部分患者往往被诊断时已发生远处转移而丧失手术机会。而无论是早期还是晚期胰腺癌患者,化疗均是有效的治疗方式,但常常因患者出现化疗耐药,导致其治疗效果不佳。因此,如何克服胰腺癌化疗耐药是亟待解决的科学难题,也是广大胰腺癌研究者所聚焦的热点问题。本课题组前期利用胰腺癌人源异种移植瘤模型(Patient-derivedtumorxenograft,PDX)进行吉西他滨药效学实验,筛选出对吉西他滨化疗敏感和耐药的PDX模型。通过对其进行高通量测序,构建耐药相关分子调控网络,从中我们发现布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂(Inhibitor of Bruton’s tyrosine kinase,IBTK)在吉西他滨耐药组中明显高表达。既往研究显示,IBTK具有促癌作用且与肿瘤细胞增殖、凋亡、化疗敏感性等生物学作用息息相关。因此,我们选择IBTK作为研究靶点,拟对其在胰腺癌中介导吉西他滨化疗耐药的分子机制进行深入探索,希冀为今后胰腺癌的治疗提供新希望。研究目的检测IBTK在胰腺癌组织中的表达及临床意义;明确IBTK对胰腺癌细胞增殖、凋亡、化疗敏感性等生物学行为的影响;探索吉西他滨诱导IBTK表达上调的具体机制;探索IBTK是否通过调控自噬及泛素化蛋白酶体降解途径影响胰腺癌化疗耐药的发生。研究方法利用生物信息学分析,绘制吉西他滨化疗敏感和耐药PDX模型间差异基因热图,筛选出吉西他滨耐药PDX中高表达的IBTK作为研究靶点。利用qRT-PCR及Western Blot对IBTK在耐药PDX模型的组织及耐药胰腺癌细胞株中的mRNA及蛋白表达进行检测。然后,对胰腺癌组织芯片进行免疫组织化学染色检测胰腺癌组织中IBTK的表达水平,使用Kaplan-Meier(K-M)生存分析及Log-rank检验,检验高/低表达IBTK患者间生存时间是否具有统计学差异。采用单因素及多因素Cox回归分析筛选影响胰腺癌患者预后的独立风险因素,评估IBTK作为胰腺癌患者预后评估的临床应用价值Immunosupresive agents。在IBTK的上游调控机制中,利用qRT-PCR检测随吉西他滨药物浓度及作用时间梯度增高后,胰腺癌中IBTK的mRNA表达情况。分析吉西他滨化疗用药前及用药后PDX模型间KEGG信号通路富集情况,使用Western Blot验证吉西他滨诱导内质网应激调控IBTK表达的具体机制。另外,IBTK在胰腺癌中具体功能的探索中,我们通过在胰腺癌细胞株中上调或下调IBTK的表达水平,采用CCK8法、流式细胞仪检测、克隆形成实验检测IBTK对胰腺癌细胞增殖、凋亡、吉西他滨化疗敏感性的影响;然后,通过构建裸鼠皮下移植瘤模型在体内明确IBTK对胰腺癌吉西他滨化疗敏感性的影响。在IBTK的下游调控机制中,通过对敲除IBTK的胰腺癌细胞株进行转录组测序及蛋白组质谱分析,推测IBTK可能调控的具体分子机制;然后,我们使用Western Blot、GFP/mRFP-LC3B双荧光染色蛋白、电子显微镜、Lyso-Tracker探针等方法,明确IBTK在胰腺癌中对自噬的调控作用;最后,我们利用CO-IP、CHX及MG132药物作用等手段探索IBTK通过调控ARID2影响自噬发生,进而介导胰腺癌化疗耐药的分子机制。研究结果IBTK在吉西他滨耐药PDX模型及耐药细胞株中表达量上调,且在胰腺癌组织中,其表达量较正常胰腺组织明显升高;IBTK的表达水平的高低是胰腺癌患者预后评估的独立危险因素。在功能学实验结果中,IBTK在胰腺癌中表达量升高可以促进胰腺癌细胞增殖、提高对吉西他滨化疗的耐受程度并抑制凋亡的发生;另外,敲低IBTK的表达能够抑制胰腺癌细胞增殖、增强对吉西他滨化疗的敏感性并促进凋亡的发生。同时,在体内实验中,利用小鼠胰腺癌皮下移植瘤模型证实过表达IBTK可以提高胰腺癌对吉西他滨的化疗耐受性。接着,在IBTselleck TofacitinibK的上游调控机制中,我们发现随着吉西他滨用药浓度的提高及作用时间的延长,IBTK的mRNA表达量越来越高,同时在胰腺癌细胞中吉西他滨能够触发内质网应激的发生,通过PERK/CHOP通路激活IBTK的表达;其次,在IBTK的下游调控机制中,我们发现在胰腺癌细胞中过表达IBTK后,可导致溶酶体功能增强,促使自噬体降解程度加强,自噬体数量减少进而促进自噬流的发生。在对IBTK下游机制的更为深入的研究中,我们发现IBTK能够与抑癌蛋白ARID2相互结合,通过影响ARID2的泛素化水平致使其被蛋白酶体水解,进而调控溶酶体功能,使胰腺癌细胞的的自噬水平发生改变,最终介导胰腺癌吉西他滨化疗耐药的发生。研究结论IBTK在胰腺癌患者中表达上调,其表达量的高低可作为评估胰腺癌患者预后的独立风险因素。在机制上,吉西他滨的刺激可以通过触发内质网应激中PERK/CHOP通路介导IBTK表达升高,进而IBTK可通过影响ARID2泛素化水平,促进抑癌蛋白ARID2被蛋白酶体水解,从而影响胰腺癌细胞的自噬状态改变,导致胰腺癌化疗耐药的发生。IBTK可能作为胰腺癌患者的预后评估标志物及潜在治疗靶点,为今后相关研究提供新思路。研究背景在消化系统肿瘤中,胰腺癌是恶性程度极高的肿瘤,预后极差,患者总体五年生存率约为10%。大部分患者就诊时已发展为局部进展或者远处转移阶段。因此对胰腺癌患者的早期筛查及深入探索胰腺癌的发生机制,进而寻找新的药物治疗靶点,对改善患者预后具有重要临床意义。在临床工作中,针对不同患者进行个体化系统性治疗的重要性日益凸显,如何利用现有技术手段,有效评估患者预后,在分子层面深入揭露胰腺癌患者的恶性生物学机制,最终辅助医生提供更为有效的个体化临床决策的问题亟需解决。随着肿瘤中各种组学检测的不断发展及大量应用,基于基因组及转录组数据,利用具有关键功能的基因建立特异性预后评估模型可以很好的为癌症患者早期诊断、评估预后和疗效提供重要的检测手段。近年来研究发现,长链非编码RNA(lncRNA)及自噬在胰腺癌的发生发展过程中具有重要作用。同时,在胰腺癌的研究中尚未见关联lncRNA及自噬基因数据,共同构建关于自噬相关lncRNA的胰腺癌预后评估模型的有关报道。因此,合理利用现有的肿瘤相关基因组、转录组等公共数据库,通过生物信息学分析的方法,鉴定胰腺癌中影响预后的自噬相关lncRNA,可以为建立更为精准的胰腺癌患者预后系统性评估模型提供有效策略。研究目的利用肿瘤公共数据库中的转录组测序数据并结合对应的临床数据,筛选胰腺癌中影响预后的自噬相关lncRNA,构建lncRNA-mRNA共表达调控网络,揭示自噬通路与lncRNA在胰腺癌中的重要作用。并借助筛选到的关键lncRNA,建立多基因预测模型,合理、有效地评估胰腺癌患者预后,为患者个体化治疗中的临床决策提供指导。研究方法首先,在癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)及国际肿瘤基因组协作联盟(International Cancer Genome Consortium,ICGC)中下载胰腺癌组织的转录组测序数据。在人类自噬相关数据库(The Human Autophagy Database,HADb)中提取所有已报道的自噬相关基因。接着,在GENCODE数据库中利用Ensemble ID对所获取的全部基因进行注释,从中提取TCGA数据库中胰腺癌的全部lncRNA测序信息。对TCGA及HADb数据库中获取的LncRNA及自噬相关基因进行Pearson相关性分析,鉴定出自噬相关的lncRNA。使用Cox回归及生存分析,识别出与预后显著相关的自噬lncRNA,并利用筛选出的基因构建风险评分模型。通过对每个患者风险评分的计算,以风险评分的中位数为临界点,将胰腺癌患者分为高风险组及低风险组。利用主成分(PCA)分析明确高风险组及低风险组间具有明显差异,证明两组间具有不同效应,划分合理。使用Kaplan-Meier(K-M)生存分析及Log-rank检验,检验高/低风险组间的胰腺癌患者的生存时间是否具有统计学差异。在ICGC数据库中进行外部独立验证,证实所构建的基因风险评分模型的稳定性。使用单因素Cox回归及多因素Cox回归分析,筛选与预后显著相关的临床或风险因素。绘制时间依赖的受试者工作特征曲线(ROC),计算ROC曲线下面积(AUC),并预测胰腺癌患者的3年生存期。通过比较风险评分模型与不同临床因素的AUC值,明确各指标的预测效能。接着,我们利用Cytoscape软件及桑基图对lncRNA-mRNA网络进行可视化分析,并使用GO功能注释及KEGG通路富集分析预测所筛选出的各基因的分子生物学功能及可能参与的生物学进程。另外,我们还采用基因集富集分析(GSEA)进一步探索高、低风险分组间与胰腺癌不良预后相关的潜在分子生物学机制。最终,我们利用qRT-PCR实验验证各个自噬相关lncRNA在正常胰腺导管上皮细胞HPNE及胰腺癌细胞PANC-1的表达情况。研究结果在TCGA数据库的胰腺癌转录组测序数据中,共提取出14142个lncRNA。然后,从中鉴定出1234个与自噬相关性高的lncRNA。根据单因素及多因素回归分析结果,最终筛选出7个与预后相关的自噬lncRNA,其中包含2个危险性基因:AC245041.2 及 LINC02257(HR>1),5 个保护性基因:AC006504.8、AC012306.2、AC125494.2、FLVCR1-DT和 AC005332.6(HR<1)。基于以上 7个基因,构建风险评分模型,将胰腺癌患者分为高风险组及低风险组。同时,无论在TCGA训练集还是ICGC验证集中,高风险组的患者生存期均低于低风险组的患者。PCA分析可见高、低风险组间存在显著性差异。通过单因素及多因素Cox回归分析发现,风险评分系统可以作为评价胰腺癌预后的独立影响因素。另外,通过比较风险评分模型与不同临床因素对胰腺癌患者3年生存期预测的AUC值,证实风险评分模型的预测效能明显优于其他传统临床指标。接下来,我们对lncRNA-mRNA调控网络进行了可视化分析,对其中基因进行GO及KEGG分析,发现自噬、泛素化蛋白调控、PI3K-Akt及FoxO信号通路显著富集。随后,利用GSEA分析高、低风险组间分子信号通路差异,发现低风险组胰腺癌的分子机制与自噬和代谢信号通路显著相关。最后,实验验证胰腺癌中危险性lncRNA(AC245041.2与LINC0225)在PANC-1中表达量显著高于HPNE,而保护性lncRNA(AC005332.6、AC012306.2、AC125494.2)在 PANC-1 中表达量显著低于 HPNE。研究结论总的来说,分析鉴定出的7个与自噬相关的lncRNA与胰腺癌的进展和预后密切相关,可能是治疗胰腺癌的新型潜在治疗靶点。同时,所绘制的自噬相关lncRNA-mRNA调控网络更为深入的解释了胰腺癌恶性行为的分子机制。另外,基于自噬相关的lncRNA构建的风险评分模Fulvestrant半抑制浓度型相较传统临床指标具有更佳的临床预后预测效能,并且经外部独立数据集合验证,具有一定的稳定性,这有益于为今后的临床决策提供指导作用。