艾滋病、癌症和器官移植等造成免疫抑制人群的不断增加,侵袭性真菌感染发生的概率也随之显著增加,导致大量的患者死亡。据统计每年全球有超过一百万人死于侵袭性真菌感染。然而,抗真菌药物不仅种类少,而且存在耐药性、毒副作用多、抗菌谱窄等问题,导致部分侵袭性真菌感染的死亡率高于50%。因此寻找安全有效的新型抗真菌药物迫在眉睫。近年来,许多新的方法与思路被引入抗真菌药物的开发,药物发现方法从最初的随机活性筛选逐步扩展到针对某一特定化合物类型、特定药物靶点或生理途径的相对理想的活性筛选。本论文分别围绕抗菌模拟肽的活性筛选和靶向病原真菌特定途径两个角度出发寻找新型抗真菌活性物质和初步构建抗真菌活性物质筛选模型。具体研究内容为:(1)MW系列γ-AA模拟肽抗真菌活性筛选及机制研究背景:MW系列γ-AA模拟肽设计思路来自于宿主防御肽,它包含γ手性肽核酸骨架、带正电的头部和疏水的尾部,其中γ手性肽核酸骨架对蛋白质水解具有优良抗性,同时带正电氨基酸和疏水氨基酸对抗菌活性很重要。目的:对蔡健峰教授实验室合成的MW系列γ-AA模拟肽的抗真菌活性进行筛选,以期获得潜在的抗真菌剂,并研究其作用机制,为后续抗真菌γ-AA模拟肽的设计提供新思路。方法:1、通过测定MW系列γ-AA模拟肽对实验室保藏致病真菌与临床耐药菌的MIC_(50)和HC_(50),并利用时间-杀菌曲线实验筛选出MW系列中抗真菌活性最好的γ-AA模拟肽。2、使用DAPI/PI双染色法和扫描电镜测定MW5对细胞膜的完整性的影响,并采用DCFH-DA染色法测定MW5对细胞内活性氧的影响。再通过25天的耐药诱导folding intermediate判断MW5是否容易产生耐药性。3、联合使用MW5与临床一线用药氟康唑通过棋盘法对实验室保藏真菌进行测定,判断MW5是否具有与氟康唑联合用药的能力,并根据不同耐药菌株生长情况推断MW5的作用靶点;采用RT-q PCR测定MW5对唑类药物耐药外排泵Mdr1、Cdr1和Cdr2的转录水平,并通过荧光成像、荧光强度测定和流式细胞术观测外排泵荧光底物在细胞内的积累,以此推测MW5与氟康唑联合的作用机制。4、使用大蜡螟模型、小鼠系统感染模型和小鼠表皮感染模型测定MW5单独使用或与氟康唑联用时的体内药效。结果:1、通过对MW系列γ-AA模拟肽的抗菌谱进行测定,筛选出MW3和MW5的抗真菌活性更好,溶血活性和时间杀菌曲线实验证明MW5的杀菌活性强于MW3且溶血性也弱于MW3,MW5对酵母菌及丝状真菌都有很强的杀菌活性,对酵母菌的MIC_(50)都为2μg/m L,对致病丝状真菌烟曲霉的MIC_(50)为4μg/m L,对毛霉的MIC_(50)为4-8μg/m L,时间杀菌曲线表明在4×MIC_(50)的条件下MW5可以在45min内杀死隐球菌H99和白色念珠菌SC5314和CARG5。2、使用DAPI/PI双染色法发现MW5在杀菌浓度下会破坏细胞膜通透性且破坏能力随MW5浓度增加而增强,在扫描电镜下也观察到杀菌浓度的MW5会导致真菌表面出现折叠和损伤,采用DCFH-DA染色法观察到MW5会诱导真菌细胞内活性氧(ROS)的产生,诱导能力随MW5浓度增加而增强,且在添加抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)清除ROS后能够降低MW5的杀菌能力。在经过25天的耐药诱导后MW5对白色念珠菌SC5314的MIC_(50)没有改变,并且氟康唑在有MW5存在的条件下经过25天的耐药诱导后MIC_(50)值仅增加了2倍。3、在联合用药实验中发现MW5与氟康唑联用对外排泵Mdr1过表达的白色念珠菌耐药株有明显的协同作用,对其他大部分菌株为增效作用,因此推测MW5增强氟康唑效力的靶点为药物外排泵Mdr1;并且RT-q PCR发现MW5对主要药物外排泵Mdr1、Cdr1和Cdr2的基因表达无显著影响,荧光成像、荧光强度测定和流式细胞术观察到亚抑菌浓度的MW5使Mdr1底物尼罗红和荧光FLC-Bodipy在耐药细胞内积累增多。4、在体内药效实验中发现MW5在野生型白色念珠菌感染大蜡螟模型中与阳性药氟康唑有相似的治疗效果;在小鼠表皮感染耐药白色念珠菌菌模型中,单独使用MW5或氟康唑治疗无明显的治疗效果,而药物联用使表皮的菌载量降低了0.6个数量级。结论:MW5具有强力的杀真菌活性和较低的JQ1毒性,且不易产生耐药性;高浓度MW5通过破坏真菌细胞膜并诱导细胞产生ROS进而导致细胞死亡,低浓度MW5与氟康唑联用时通过破坏药物外排泵Mdr1使氟康唑在真菌细胞内有效浓度增加而增效,并且在体内药效模型中MW5也能有效治疗真菌感染。(2)靶向隐球菌Prp8内含肽药物筛选模型的初步构建背景:真菌蛋白的选择性剪接通常由内含肽(Intein)介导。在致病真菌新生隐球菌的m RNA剪接体核心蛋白Prp8中含有一个保守的内含肽序列。内含肽抑制剂导致内含肽不能被剪接时,功能性Prp8就无法形成,从而破坏隐球菌m RNA剪接过程和抑制隐球菌的生长繁殖。目的:本论文拟构建Prp8 intein的全细胞筛选模型,包括无内含肽敲除株和Prp8诱导表达菌株,用于今后的内含肽抑制剂的筛选。方法:1、使用CRISPR-Cas9方法构建Prp8条件表达株和Intein缺失株,并通过PCR验证目的片段大小、表型验证目的菌株的生长、RT-q PCR验证prp8表达和Western Blot验证Prp8蛋白表达等方法验证菌株构建是否成功。2、构建Intein表达重组质粒,使用Ni柱亲和层析纯化表达蛋白。3、通过转录组测序比较新生隐球菌在有无靶向Intein阳性药6G-318SVX-765浓度处理下的差异表达基因,并寻找特异的差异基因作为Biomarker。结果:1、本研究成功构建了启动子pCTR4诱导的Prp8条件表达株,PCR验证菌株构建成功,表型实验表明Cu~(2+)能够有效抑制P_(CTR4)-prp8菌株生长,RT-q PCR实验表明Cu~(2+)能够有效抑制prp8基因表达,Western Blot实验表明Cu~(2+)能够抑制Prp8蛋白表达,PCR和表型实验验证Intein缺失株构建成功;2、成功在大肠杆菌Rosetta(DE3)宿主中异源表达Intein,但未能获得纯蛋白。3、在转录组测序后推测表达量变化中最高的20个基因中与内含子含量变化相关的4个功能基因作为Biomarker。结论:本研究成功构建了诱导启动子pCTR4的诱导表达Prp8菌株,该菌株可以模拟Prp8的低表达状态,提高菌株对抑制剂响应的敏感性,还成功构建了Intein缺失株,该菌株对内含肽抑制剂的敏感性可能将降低,本论文的研究结果为进一步筛选靶向新生隐球菌Prp8内含肽的抑制剂奠定了坚实的基础。