棒曲霉素(Patulin,PAT)和赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)是广泛存在于苹果汁中的真菌毒素,会对人体的肝脏、肾脏和免疫系统产生不良影响。由于PAT具有免疫原性较低、分子量小的特点,所以通过免疫学方法制备其抗体较为困难。适配体是一种能特异性识别靶标的寡核苷酸链,具有稳定性好、亲和力高和易于化学修饰等优点。本研究通过对本课题组筛选所得的PAT适配体的原始序列进行截短优化,并结合圆二色谱和分子对接技术,研究了适配体与靶标识别前后的空间构象变化和关键结合域。基于适配体和金属纳米簇构建了一系列灵敏、准确的PAT和OTA的荧光检测方法。主要工作内容如下:首先,对原长为80个碱基的PAT适配体的茎环结构selleck化学依次裁剪,得到30个碱基的截短适配体P-30,基于圆二色谱和分子对接探究了P-30与PAT识别前后的构象变化以及P-30参与识别的关键碱基。同时,基于DNaseⅠ的酶切信号放大作用建立了PAT的检测方法。将截短适配体P-30和金纳米簇相连作为荧光探针(Au NCs-Apt),其荧光被二氧化锰纳米片(Mn O_2NFs)淬灭。适配体P-30与PAT的识别使得Au NCs-Apt从Mn O_2NFs表面解离,DNaseⅠ可以酶切Au NCs-Apt-PAT复合物,释放PAT去循环参与反应,荧光信号实现扩增。在最优实验条件下,PAT在0.01～100 ng/m L范围内与荧光信号数值的线性关系良好,检测限为8.5×1BIBW2992 molecular weight0~(-3) ng/m L,对1 ng/m L PAT的检测精密度为2.36%(RSD,n=11)。在苹果汁中的加标回收率为96.05%～101.27%,相对标准偏差为2.44%～7.4wildlife medicine3%。其次,基于对OTA适配体空间构象的研究,构建了比率型荧光检测OTA的方法。一方面,有机染料NMM用来标记OTA适配体的G-四链体结构(Apt-NMM);另一方面,铜纳米簇修饰适配体互补链(Cu NCs-c DNA)的荧光可以被聚多巴胺球淬灭。在410nm激发波长条件下,荧光体Cu NCs-c DNA和Apt-NMM的发射峰分别为于510 nm和610 nm。随着适配体与OTA的特异性识别以及G-四链体的形成,通过测定两个荧光发射峰的强度变化,以I_(610)/I_(510)的比值作为输出信号,在最优实验条件下,对OTA检测的线性范围为0.05～100 ng/m L,检测限为0.045 ng/m L,对1 ng/m L OTA的检测精密度为2.48%。在苹果汁中加标回收率为93.89%～102.67%,相对标准偏差为2.05%～8.75%。最后,利用合成的两种荧光性能增强的金纳米簇修饰的适配体探针,建立了同时检测PAT和OTA的方法。检测体系经405 nm波长激发,在650 nm和530 nm处有两个荧光特征峰,分别对应PAT的适配体探针Cys@BSA-Au NCs-Apt1和OTA的适配体探针Arg@ATT-Au NCs-Apt2。在没有靶标的情况下,两种适配体探针与磁珠上的互补链碱基配对;随着PAT和OTA的加入,适配体探针与各自靶标识别而脱离磁珠,然后磁分离至上清液中。在最优实验条件下,实现了对PAT和OTA的同时检测并建立了相应的标准曲线,线性范围为0.10～50 ng/m L,PAT和OTA的检测限为0.09 ng/m L和0.06 ng/m L。苹果汁中PAT和OTA的加标回收率分别为91.33%～107.23%和94.17%～107.47%,相对标准偏差分别为4.27%～7.84%和4.33%～8.50%。