微生物可以产生许多结构、活性多样的天然产物,是新型抗生素和抗肿瘤药物的重要来源。耐药菌的不断出现,对人类的公共卫生造成了很大的威胁,因此从微生物中发现新结构或新作用机制的活性天然产物就变得尤为迫切。伯克氏菌目细菌是生态和代谢多样化的革兰氏阴性细菌,因其产生的天然产物数量较多、结构新颖较高、生物活性良好,逐渐成为重要的天然产物产生菌和天然产物挖掘的目标菌。此外,海洋环境也是新型天然产物的重要来源,许多海洋微生物为了适应复杂多变的海洋环境,产生大量结构独特的次级代谢产物,因此也是新型天然产物的重要生产者。本研究以挖掘新型活性天然产物为研究目标,以基因组序列为导向结合基因簇异源表达对伯克氏菌科的韩国几丁质单胞菌Chitinimonas koreensis DSM 17726进行天然产物挖掘;同时利用OSMAC(One Strain Many Compounds)策略对从青岛鳌山湾海洋沉积物中的分离获得的潜在新菌种Marinoscillum sp.YZ09进行天然产物分离和鉴定。主要的研究内容与结果如下:(1)基于基因组序列定向挖掘韩国几丁质单胞菌中非核糖体肽天然产物基因组序列分析表明韩国几丁质单胞菌ChitiBIBW2992说明书nimonas koreensis DSM 17726具有四个未知的非核糖体肽合成酶(NRPS,Nonribosomal peptide synthetase)生物合成基因簇(BGCs,Biosynthetic gene clusters)—BGC1、BGC3、BGC10、BGC11,均与已知NRPS的相似度较低,推测可能产生新型的脂肽或环肽类化合物。BGC1大小为54 kb,含有12个NPPS模块且起始模块具有起始缩合结构域,推测其产物为带有脂链的十二肽类化合物。通过基因簇的直接克隆、插入转座元件及组成型启动子Papra,在异源宿主 Schlegelalla brevitalea DSM 7029-Aglb中进行异源表达,获得一系列的差异峰。通过分离纯化及高分辨率质谱、核磁共振和Marfey’s水解等方法分离并鉴定了其中的两个新型脂肽——chitinipAMG510半抑制浓度eptins A和B,该类化合物N端带有含正十四烷酰基连接在由十二个氨基酸缩合而成的多肽骨架上,其中包含了非天然氨基酸Dhb(dehydrobutyrine),D-Dab(2,4-二氨基丁酸),D-Ser,D-Lys,D-Glu,D-Asp。进一步通过二级质谱碎片分析,推测了另外四个化合物结构——chitinipeptins C、D、E和F。生物活性测试结果表明,该化合物具有微弱的细胞毒性,但有较强的表面活性剂活性,可以促进细菌在固体基质表面的集群运动。BGC3大小为61kb,其含有与Fe3+相关的透性酶基因和脱氢酶基因,其产产物可能为铁载体化合物。对该基因簇进行直接克隆、插入启动子和异源表达,通过HPLC-MS以及铁载体活性测试,检测到了 BGC3的产物,经过MS/MS分析发现该产物与Vibrio anguillarum serotype O2 strains产生的铁载体——vanchrobactin平面结构一致,但是基因簇组成具有一定差异,可能存在进化上的不同。铁载体可为细菌捕获外界环境中的Fe3+以供自身代谢所hepatic protective effects需。同时成功对BGC10与BGC11进行了直接克隆与异源表达,但初步发酵尚未检测到产物,需要进一步优化条件和方法。(2)海洋沉积物中潜在新菌的分离及其产物的分离与鉴定从来源于青岛市鳌山湾的海泥、海洋动物、海洋植物样品中,共分离得到9株细菌。通过16s rDNA的比对,发现YZ0菌株与Marinoscillum属的Marinoscillumluteum strain A03A-221 的一致性为 94.95%,可能是潜在的新菌种,将其命名为Marinoscillumsp.YZ09。利用OSMAC的方法对YZ09菌株进行了发酵检测和化学筛选,分离并鉴定了一个新型吡嗪酮生物碱类化合物marinopyrazinone C,该化合物以吡嗪酮环为基本母核,并由6-甲基辛基和另外两个甲基取代。并通过基因组序列分析和同位素氨基酸喂养实验初步推测该化合物的生物合成机制。综上所述,本研究利用基于细菌基因组序列的新型天然产物挖掘技术和经典的基于新菌株资源的OSMAC挖掘策略,从C.koreensis DSM 17726中的发现了一类新型脂肽类天然产物chitinipeptins,具有良好的表面活性剂活性;从海洋来源的潜在新菌种Marinoscillum sp.YZ09中获得了新型吡嗪酮生物碱marinopyrazinone C。本研究不仅发现和鉴定了新型天然产物,再次证明了基因组序列指导的基因组挖掘和筛选潜在新菌种资源是发现新型天然产物的重要手段,对于天然产物挖掘的重要性和可行性。