一、研究背景:原发干燥综合征肾小管间质损伤(Renal tubulointerstitial injury in primary Sjogren’s syndrome,pSS-TIN)是干燥综合征肾脏受累的最常见表现。我国pSS人群患病率高达0.33%～0.77%,其中30%-50%有肾脏受累,75%肾活检pSS患者病理为TIN。本课题组前期在pSS-TIN患者肾组织中发现异位生发中心(ectopic germinal center,EGC),推测其与pSS-TIN致病密切相关。B细胞在生发中心暗区增殖,在生发中心明区接受滤泡辅助T细胞(Follicular helper T cell,Tfh细胞)呈递的共刺激信号及滤泡树突状细胞(Follicular dendritic cell,FDC)呈递的抗原信号,反复往返迁移以完成细胞突变和抗体亲和力成熟。趋化因子受体CXCR5是B细胞迁移的关键条件,异常表达可趋化免疫细胞聚集至非淋巴组织(如肾小管间质)形成异位生发中心。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammlian target of rapamycin,mTOR)是Cobimetinib支持B细胞快速增殖和克隆扩增的必要条件。程序性死亡受体(programmed death-1,PD-1)是抑制性免疫检查点受体,在T细胞活化后表达上调,以耗竭T细胞及相关免疫反应,维持正常的免疫耐受;生发中心中,PD-1与在Tfh中与可诱导共刺激分子对CXCR5相互拮抗,共同控制Tfh细胞的位置及Tfh细胞的活跃程度。pSS患者唾液腺PD-1表达量升高且与pSS活动度正相关,提示PD-1可能出现功能障碍,那么pSS-TIN肾组织中PD-1/PD-L1表达量如何?是否与pSS疾病表现相关?EGC参与了 pSS-TIN的起病机制,CXCR5和mTOR在EGC的形成起到关键作用,那么抑制CXCR5、抑制mTOR能否治疗pSS-TIN呢,目前尚无相关研究报道。二、研究目的1.回顾性分析pSS-TIN患者的临床病理特点与治疗预后;2.建立pSS小鼠肾损伤模型,评价肾组织PD-1、mTOR及CXCR5表达水平改变;3.探究抑制CXCR5及mTOR对pSS小鼠模型肾损伤的影响。三、研究方法1.1993年1月至2023年4月间在北京协和医院住院,结合临床及肾脏病理诊断为pSS-TIN的病例共136例,收集、回顾性总结患者人口学、临床表现、血尿指标、病理表现、治疗及预后随访资料,主要终点事件定义为终末期肾病或死亡。2.无菌条件下取C57BL/6J雌鼠肾脏皮质,用胶原酶Ⅳ充分消化后使用70μm及40μm筛网过滤去除未消化组织及肾小球,离心获取肾小管组织,PBS重悬后充分破碎细胞,离心收集上清即肾小管抗原原液,BCA蛋白定量法测定浓度,用无菌PBS稀释至2 mg/mL。建模组分别在第0天、第7天于小鼠的腹股沟区皮下多点注射小鼠肾小管抗原乳化剂(由肾小管抗原+弗氏完全佐剂配置,最终肾小管抗原浓度1mg/mL)100μL/20g,第14天同样方法皮下注射小鼠肾小管抗原乳化剂(由肾小管抗原+弗氏不完全佐剂配置,最终肾小管抗原浓度0.5mg/mL)100μL/20g。对照组同期皮下注射等量完全弗氏佐剂/不完全弗氏佐剂。观察小鼠生活习性改变,测量基线及建模不同周龄的唾液流率;留取小鼠基线及建模第6、8、11周24h尿和周静脉血血清,测定饮水量、测定血肌酐、尿素、钾、磷及尿钾、尿磷、尿总蛋白、尿肌酐,计算尿磷排泄分数、尿钾排泄分数。ELISA法测定11周血清抗SSA、抗SSB水平。建模11周处死小鼠,获取肾脏及颌下腺完成常规病理检查;提取肾组织总蛋白,免疫印迹法探究肾组织肾小管损伤标记物KIM-1 和 PD-1 水平。3.分别使用CXCR5及mTOR抑制剂干预干燥综合征小鼠肾损伤模型,评估饮水量、唾液流率及血电解质变化,提取肾组织总蛋白,免疫印迹法评价肾组织CXCR5、mTOR和KIM-1表达量变化。4.统计软件IBM SPSS Statistics 26。符合正态分布的定量资料以平均值±标准误表示,否则以中位数及四分位数表示;定性资料以构成比表示。满足正态分布且方差齐性的组间对比采用独立样本t检验,否则采用秩和检验。自身前后对比采用配对t检验或重复测量资料的方差比较。图形呈现软件为GraphPad Prism 8。蛋白免疫印迹法半定量分析软件为ImageJ。四、研究结果(一)原发干燥综合征伴肾小管间质损伤患者临床预后分析本研究共纳入136例pSS-TIN患者,以中年女性为主,平均年龄40.7±13.5岁,男女比例1:11.4,主要肾脏损伤表现为低钾血症(76.1%)和肾小管酸中毒(64.0%),平均血肌酐为 116(53～331)μmol/L,eGFR 为 51.50(12.80～130.92)ml/min/1.73m2,其中eGFR<60 ml/min/1.73m2患者占61.0%。患者病理表现为急性间质性肾炎,无明显肾小球病变。124例患者接受了糖皮质激素治疗,72例患者联合免疫抑制剂或生物制剂治疗,最常见方案为联合环磷酰胺(33.1%)和吗替麦考酚酯(9.6%)。单纯激素治疗、激素联合环磷酰胺治疗6个月后患者的肾功能较自身基线均有改善且在此后的随访中维持肾功能稳定。(二)干燥综合征小鼠肾损伤及CXCR5、mTOR通路激活1.干燥综合征模型:建模组小鼠免疫3周开始逐渐出现搔抓口唇、舔爪现象,饮水量增加(建模8周,建模组6.61±0.33 g/24h vs.对照组5.04±0.26 g/24h,P<0.01),唾液分泌减少(建模11周,建模组4.45±0.64 mg/min vs.对照组9.56±0.39 mg/min,P<0.001)。血清免疫指标抗SSA抗体及抗SSB抗体升高,颌下腺病理表现为散在淋巴细胞浸润;2.干燥综合征肾损伤:与对照组小鼠相比,建模组小鼠第8周尿量(1.25±0.10ml/24h 比 0.89±0.15ml/24h,P<0.01)、24h 尿蛋白定量增加(2.9±0.2 g/24h比1.2±0.1 g/24h,P<0.001)。尿钾、尿磷排泄量及排泄分数分别为对照组的2.78和 2.08 倍,血钾(3.5±0.2mmol/L 比 4.5±0.2mmol/L,P<0.001)及血磷(1.69±0.06mmol/L 比 2.62 ± 0.10mmol/L,P<0.000)降低。3.干燥综合征肾损伤病理及机制探索:建模组小鼠肾间质可观察到多处灶状淋巴细胞聚集,免疫印迹法显示肾小管损伤标记KIM-1表达量较对照组显著增高;肾组织PD-1表达量与对照组无显著性差异,但mTOR(0.97±0.09 vs.0,43 ±0.01,P<0.05)及 CXCR5(Alpelisib1.11±0.13 vs.0.62±0.08,P<0.05)表达升高。(三)抑制CXCR5或mTOR对干燥综合征小鼠肾损伤的治疗作用评估1.雷帕霉素治疗干燥综合征小鼠:小鼠唾液流率增加(7.00±0.45 mg/min 比4.45 ±0.64 mg/min,P<0.01)、饮水量(4.49±0.22 g/24h 比6.51±0.3therapeutic mediations9 g/24h,P<0.01)和尿量减少(0.55±0.10 mL/24h 比1.31±0.09 mL/24h,P<0.001)。血尿酸(304±5 umol/L 比 238±26 umol/L,P<0.05)及血磷(2.64±0.07 mmol/L 比 2.01±0.12 mmol/L,P<0.01)水平升高,尿尿酸量(0.46±0.11 mmol/24h 比 0,99±0.11 mmol/24h,P<0.05)减少。肾组织肾小管损伤标记物KIM-1表达量较建模组显著降低,mTOR表达量减低。2.TAK-779治疗干燥综合征小鼠:小鼠唾液流率(6.86±0.70 mg/min 比4.45±0.64 mg/min,P<0.05)增加、饮水量(3.99±0.64 g/24h 比6.51±0.39 g/24h,P<0.01)减少、尿量(0.59±0.08 mL/24h 比 1.31±0.09 mL/24h,P<0.001)增加。血磷水平升高(2.39±0.11 mmol/L 比 2.01±0.12 mmol/L,P<0.05),24h尿总蛋白定量(1.0±0.2g/24h 比 1.7±0.2g/24h,P<0.05)及尿尿酸量(0.52±0.09mmol/24h 比0.99±0.11mmol/24h,P<0.05)减少,肾小管损伤标记物 KIM-1 表达量(0.39±0.05 vs 0.83±0.08,p<0.01)较建模组显著降低,同时抑制趋化因子受体CXCR5表达量减低,mTOR表达量下降。五、结论:在本研究条件下:1.pSS-TIN好发于中年女性,主要肾脏损伤表现为低钾血症、肾小管酸中毒和肾功能不全,单纯激素治疗与激素联合免疫抑制剂均可有效改善患者肾功能。2.成功建立干燥综合征小鼠肾损伤模型:建模组出现搔抓口唇、舔爪现象,饮水量增加、唾液分泌减少,血清抗SSA抗体及抗SSB抗体升高,颌下腺出现淋巴细胞散在浸润;肾脏受累方面,建模组小鼠尿量、24h尿蛋白定量增加,尿钾、尿磷排泄量及排泄分数升高,血钾及血磷降低。建模组小鼠肾间质可观察到多处灶状淋巴细胞聚集,肾小管损伤标记KIM-1表达量增高。建模组肾组织PD-1表达量与对照组无显著性差异,但存在CXCR5和mTOR通路激活。3.予以CXCR5抑制剂TAK-779或mTOR抑制剂雷帕霉素干预干燥综合征肾损伤小鼠3周,可分别观察到肾组织CXCR5和mTOR表达降低,且均可观察到干燥症状(唾液流率减少、饮水量增加)、肾小管功能损伤(尿量增加、尿酸和磷排泄增多)及肾小管损伤标记物KIM-1升高现象获得改善。