阿尔茨海默病(AD)是最常见的痴呆症类型,是以淀粉样蛋白(Aβ)聚集造成的脑内老年斑(SP)沉积和Tau蛋白过度磷酸化形成的神经纤维缠结(NFT)为病理学特征的进行性神经退行性疾病。研究发现,AD发生发展的同时伴随着神经发生降低和神经元丢失,也是AD认知功能障碍的重要原因之一。c AMP反应元件结合蛋白(CREB)通过自身的磷酸化和去磷酸化作用参与神经细胞的增殖分化、周期调控和突触可塑性调节等重要生理活动。研究表明,神经发生与神经元功能受多条信号通路的调节,其中Ras-ERK-CREB信号通路已被证实对神经元具有重要调节作用。脑源性神经营养因子(BDNF)和酪氨酸激酶B(Trk B)结合后,激活Ras-ERK-CREB下游信号通路,使CREB ser133位点磷酸化,影响下游与神经元存活、分化和再生密切相关的BDNF、NGF和EGR-1等神经生长因子基因和蛋白表达,对神经产生保护作用。长期的研究发现,Aβ沉积与神经元功能障碍和神经元丢失密切相关,Aβ_(25-35)是已被证实有神经毒性能有效损伤神经细胞,是建立体外拟AD模型的常用工具。BI-D1870是一种RSK特异性抑制剂,可以使Ras-ERK-CREB信号通路中RSK脱磷酸降低其活性,间接降低CREB磷酸化,下调其下游神经生长因子基因和蛋白表达,使神经发生降低。Rolipram是CREB磷酸化激活剂,可通过抑制c AMP的水解,间接增加CREB磷酸化蛋白水平,促进神经发生。黄酮类化合物可以通过神经元上的多种黄酮类结合位点如Trk B等对神经退行性疾病起到预防或治疗作用。半枝莲黄酮(SBFs)是半枝莲地上部分分离纯化的黄酮类化合物,以野黄芩苷为主,具有解热、抗突变和抗氧化等多种功效。本实验室前期研究发现SBFs具有神经细胞保护作用、抗炎、抗氧化和改善记忆障碍等药理活性。小鼠脑神经瘤母细胞(N2a)具有神经细胞特征,常作为神经细胞的代用Pevonedistat细胞用于研究AD。本研究以N2a细胞为研究对象,建立Aβ_(25-35)损伤模型,观察SBFs对Aβ_(25-35)所致N2a细胞损伤的保护作用以及对Ras-ERK-CREB信号通路上相关信号分子mRNA和蛋白表达水平的影响,特别是对CREBser133位点磷酸化的影响。为了明确SBFs对N2a细胞损伤保护作用的机制,我们利用CREB磷酸化间接抑制剂BI-D1870与激活剂Rolipram,确定SBFs对Aβ_(25-35)所致N2a细胞损伤的保护作用是可能通过促进CREB的ser133位点磷酸化来完成的。目的:探讨SBFs减轻Aβ_(25-35)所致N2a细胞损伤的作用,并利用CREB磷酸化间接抑制剂BI-D1870和激活剂Rolipram确定SBFs该作用的分子机制。方法:1.N2a细胞鉴定N2a细胞体外培养,倒置显微镜观察细胞形态,免疫荧光法(IF)鉴定神经细胞特异性蛋白Neuro D1、Neu N和DCX。2.Aβ_(25-35)对N2a细胞损伤浓度筛选设置35、50、75和100μmol·L~(-1) Aβ_(25-35)系列浓度作用N2a细胞12h,倒置显微镜观察细胞形态,CCK-8法检测细胞存活率,丙酮酸还原法检测细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)释放量,筛选Aβ_(25-35)对N2a细胞损伤浓度。3.BI-D1870对N2a细胞损伤浓度与损伤时间的筛选设置10、20、40、60和80μmol·L~(-1) BI-D1870系列浓度和6、8、12、16和24 h系列时间作用于N2a细胞,观察N2a细胞形态、检测细胞存活率和LDH释放量,筛选BI-D1870对N2a细胞损伤浓度和损伤时间。4.SBFs和Rolipram对N2a细胞毒作用设置50、75、100、125和150 mg·L~(-1)SBFs以及50、75、100、125和150 mg·L~(-1)Rolipram系列浓度作用N2a细胞12 h,检测细胞存活率和LDH释放量筛选SBFs和Rolipram对N2a细胞毒作用浓度。5.SBFs和Rolipram对BI-D1870引起N2a细胞损伤保护浓度的筛选设置8.75、17.5、35、70和100 mg·L~(-1)SBFs以及60、80、100、120和14点击此处0 mg·L~(-1)Rolipram系列浓度作用N2a细胞12 h,通过检测细胞存活率和LDH释放量,筛选SBFs和Rolipram对N2a细胞损伤的保护浓度;6.SBFs和Rolipram对Aβ_(25-35)及BI-D1870引起N2a细胞损伤的保护作用设置空白对照组、溶剂对照组、Aβ_(25-35)100μmol·L~(-1)组、Aβ_(25-35)+17.5、35和75 mg·L~(-1) SBFs三组和Aβ_(25-35)+Rolipram100 mg·L~(-1)组以及BI-D1870 40μmol·L~(-1)组、BI-D1870+SBFs17.5、35和75 mg·L~(-1)三组和BI-D1870+Rolipram100 mg·L~(-1)组共12组,通过观察N2a细胞形态、检测细胞存活率和LDH释放量,确定SBFs和Rolipram对Aβ_(25-35)及BI-D1870引起的N2a细胞损伤的保护作用。7.SBFs和Rolipram对Aβ_(25-35)及BI-D1870引起N2a细胞BDNF、Trk B、Ras、ERK、RSK、CREB、EGR-1和NGF mRNA和蛋白表达异常的影响通过实时荧光定量PCR(qPCR)检测N2a细胞Ras、ERK、RSK、CREB和EGR-1 mRNA表达水平,免疫荧光(IF)检测N2a细胞BDNF和p-ERK蛋白表达水平,蛋白免疫印记(WB)检测N2a胞Trk B、Ras、ERK、p90RSK、CREB、p-CREB-Ser133、EGR-1和NGF的蛋白表forced medication达水平。结果:1.N2a细胞鉴定免疫荧光可检测到N2a细胞有神经细胞特异性蛋白Neuro D1、Neu N和DCX阳性表达,确定N2a细胞可作为神经元的代用细胞用于神经系统疾病的研究。2.Aβ_(25-35)对N2a细胞损伤浓度筛选35、50、75和100μmol·L~(-1)系列浓度Aβ_(25-35)作用于N2a细胞12 h,与溶剂对照组相比,不同浓度的Aβ_(25-35)均能使N2a细胞形态异常,细胞存活率降低(P<0.01)。35和50μmol·L~(-1)Aβ_(25-35)组LDH释放量与溶剂对照组相比无显著性差异,75μmol·L~(-1)时LDH释放量开始增加(P<0.05)。Aβ_(25-35)100μmol·L~(-1)作用12 h条件下N2a细胞聚团明显,折光率降低,细胞存活率在80%左右,LDH释放量增长率最高,确定100μmol·L~(-1)作为Aβ_(25-35)对N2a细胞损伤浓度3.BI-D1870对N2a细胞损伤浓度与损伤时间的筛选10、20、40、60和80μmol·L~(-1)系列浓度BI-D1870以及6、8、12、16和24 h系列时间作用于N2a细胞,与溶剂对照组相比,随着BI-D1870作用浓度增加和作用时间延长,N2a细胞受损程度逐渐增加,细胞形态发生异常改变,细胞存活率逐渐降低(P<0.01),培养液中LDH先升高后降低(P<0.01)。40μmol·L~(-1)作用12 h条件下N2a细胞肿胀明显,折光率降低,细胞存活率在60%左右,LDH释放量增长率最高,确定40μmol·L~(-1)作用12 h作为BI-D1870对N2a细胞损伤浓度和损伤时间。4.SBFs和Rolipram对N2a细胞毒作用50、75、100、125和150 mg·L~(-1)系列浓度SBFs作用于N2a细12h,与溶剂对照组比较,50 mg·L~(-1)SBFs可以提高N2a细胞存活率(P<0.05),LDH释放量无显著性差异,当SBFs浓度达到100 mg·L~(-1)开始,细胞存活率逐渐降低(P<0.05),培养液中LDH逐渐升(P<0.01),SBFs对N2a细胞开始产生毒作用的浓度为100 mg·L~(-1)。50、75、100、125和150 mg·L~(-1)系列浓度Rolipram作用于N2a细12h,与溶剂对照组相比,50 mg·L~(-1)Rolipram可以提高N2a细胞存活率(P<0.01),降低培养液中LDH释放量,75、100和125 mg·L~(-1)Rolipram组N2a细胞存活率和LDH释放量与对照组相比无显著性差异,当Rolipram浓度达到150 mg·L~(-1)时,细胞存活率降低(P<0.01),培养液中LDH释放量增高(P<0.01),Rolipram对N2a细胞开始产生毒作用的浓度为150 mg·L~(-1)。5.SBFs和Rolipram对BI-D1870引起N2a细胞损伤保护浓度的筛选8.75、17.5、35、70和100 mg·L~(-1)系列浓度SBFs筛选对N2a细胞损伤的保护浓度,与空白对照组相比,溶剂对照组N2a细胞存活率和LDH释放量均无显著性差异。与溶剂对照组相比,BI-D1870 40μmol·L~(-1)组可以降低N2a细胞存活率(P<0.01),提高LDH释放量(P<0.01)。与BI-D1870组相比,SBFs8.75、17.5和35和70 mg·L~(-1)组可以逐渐提高N2a细胞存活率(P<0.01)。不同浓度SBFs组均能降低LDH释放量(P<0.05),SBFs17.5、35和70 mg·L~(-1)三组效果最佳。选择17.5、35和70 mg·L~(-1)作为SBFs对N2a细胞损伤的保护浓度。60、80、100、120和140 mg·L~(-1)系列浓度Rolipram筛选对N2a细胞损伤的保护浓度,与空白对照组相比,溶剂对照组N2a细胞存活率和LDH释放量均无显著性差异。与BI-D1870组相比,不同浓度Rolipram均能提高N2a细胞存活率(P<0.01),降低LDH释放量(P<0.05),Rolipram100 mg·L~(-1)组提高细胞存活率最高,降低LDH释放量最明显。选择100 mg·L~(-1)作为Rolipram对N2a细胞损伤的保护浓度。6.SBFs和Rolipram对Aβ_(25-35)及BI-D1870引起N2a细胞损伤的保护作用根据上述结果,设置空白对照组、溶剂对照组、Aβ_(25-35)100μmol·L~(-1)组、Aβ_(25-35)+SBFs17.5、35、75 mg·L~(-1)三组和Aβ_(25-35)+Rolipram100 mg·L~(-1)组以及BI-D1870 40μmol·L~(-1)组、BI-D1870+SBFs17.5、35、75 mg·L~(-1)三组和BI-D1870+Rolipram100 mg·L~(-1)组共12组检测SBFs和Rolipram对BI-D1870及Aβ_(25-35)引起的N2a细胞损伤的保护作用,与空白对照组相比,溶剂对照组N2a细胞形态无变化,细胞存活率和LDH释放量均无显著性差异。与溶剂对照组相比,Aβ_(25-35)组细胞网状结构破坏,细胞聚团,折光率降低,细胞存活率降低(P<0.01),LDH释放量增高(P<0.01),而SBFs17.5、35和70 mg·L~(-1)三组和Rolipram100 mg·L~(-1)组均能改善Aβ_(25-35)所致的N2a细胞形态异常改变,提高细胞存活率(P<0.01),降低LDH释放量(P<0.01);BI-D1870组细胞网状结构破坏,细胞水肿,折光率降低,细胞存活率降低(P<0.01),LDH释放量增高(P<0.01),相对应的SBFs17.5、35和70 mg·L~(-1)三组和Rolipram100 mg·L~(-1)组均能改善BI-D1870所致的N2a细胞形态异常改变,提高细胞存活率(P<0.01),降低LDH释放量(P<0.01)。7.SBFs和Rolipram对Aβ_(25-35)及BI-D1870引起N2a细胞BDNF、Trk B、Ras、ERK、p-ERK、p90RSK、CREB、p-CREB-Ser133、EGR-1和NGF mRNA和蛋白表达水平异常的影响qPCR检测结果显示,与空白对照组相比,溶剂对照组Ras、ERK、RSK、CREB和EGR-1 mRNA表达无显著性差异(P>0.05),CREBmRNA表达水平增高(P<0.01)。与溶剂对照组相比,Aβ_(25-35)组中N2a细胞ERK、RSK、CREB和EGR-1 mRNA表达水平降低(P<0.01),Ras mRNA无显著变化,SBFs和Rolipram能不同程度调节Aβ_(25-35)所致N2a细胞ERK、RSK、CREB和EGR-1 mRNA的异常表达(P<0.01);与溶剂对照组相比,BI-D1870组中N2a细胞RSK、CREB和EGR-1mRNA表达水平降低(P<0.01),Ras、ERKmRNA表达增加(P<0.01),SBFs和Rolipram能不同程度调节BI-D1870所致N2a细胞Ras、ERK、RSK、CREB和EGR-1 mRNA的异常表达(P<0.01)。IF与WB检测结果显示,与空白对照组相比,溶剂对照组BDNF、TrkB、Ras、p-ERK、p90RSK、p-CREB-Ser133、EGR-1和NGF蛋白表达无显著性差异(P>0.05),Ras、ERK、CREB蛋白表达水平增高(P<0.01)。与溶剂对照组相比,Aβ_(25-35)组中N2a细胞BDNF、Trk B、p-ERK、p90RSK、CREB、p-CREB-Ser133和NGF蛋白表达水平降低(P<0.01),Ras、ERK和EGR-1蛋白表达水平增加(P<0.01),SBFs和Rolipram能不同程度调节Aβ_(25-35)所致N2a细胞BDNF、Trk B、Ras、ERK、p-ERK、p90RSK、CREB、p-CREB-Ser133、EGR-1和NGF蛋白的异常表达(P<0.05);与溶剂对照组相比,BI-D1870组中N2a细胞BDNF、ERK、p-ERK、p90RSK、p-CREB-Ser133、EGR-1和NGF蛋白表达水平降低(P<0.01),Ras和CREB蛋白表达水平增加(P<0.01),Trk B蛋白表达无显著性差异(P>0.05),SBFs和Rolipram能不同程度调节BI-D1870所致N2a细胞BDNF、Ras、ERK、p-ERK、p90RSK、CREB、p-CREB-Ser133、EGR-1和NGF蛋白的异常表达(P<0.05)。结论:1.Aβ_(25-35)可引起N2a细胞损伤及Ras-ERK-CREB信号通路相关信号分子异常改变,特别是能够降低p-CREB-Ser133蛋白的表达水平。2.SBFs对Aβ_(25-35)所致N2a细胞损伤有保护作用,调节Ras-ERK-CREB信号通路相关信号分子的表达,特别是可增加p-CREB-Ser133蛋白的表达水平。3.利用CREB间接抑制剂BI-D1870与激活剂Rolipram,确认了SBFs对N2a细胞损伤的保护作用是可能通过促进CREB的Ser133位点磷酸化来完成的。