研究目的:大麻二酚(Cannabinoid,CBD)是大麻(Cannabis sativa L.)植物的主要化学成分,具有镇痛、抗炎、神经保护和抗氧化等特性。与大麻植物中发现的大麻素四氢大麻酚(THC)不同,CBD没有精神作用,在越来越多的国家中作为一种非处方药物使用。随着美国联邦政府将四氢大麻酚含量低于0.3%(干重)作为2018年12月签署的《农业法案》的一部分,CBD在慢性病患者中的受欢迎程度大幅上升。运动训练对机体氧化应激水平具有比较复杂的影响,这取决于年龄、性别、训练水平,运动强度和时间等多方面。定期的训练产生的活性氧有利于健康,然而急性有氧、无氧运动会导致活性氧过剩对机体产生不利影响。为了确定CBD对运动疲劳骨骼肌氧化应激作用的影响,本研究通过生物信息学方法,筛选CBD对运动疲劳骨骼肌氧化应激影响的潜在作用靶点,为后续深入研究New medicine提供生物信息学基础。研究方法:通过GEO(Gene Expression Omnibus)数据库筛选运动疲劳的基因表达数据集,筛选标准为:1.通过高通量转录组测序进行分析。2.测序样本来自人体组织。3.样本量大于10。利用R软件(3.4.1版)中预处理核心包”Limma”对阵列数据进行归一化处理,根据注释信息将探针转换为基因名。将差异基因阈值设置为|log2(FC)|≥1和P<0.05,对运动疲劳组和安静对照组进行差异基因的筛选。利用"CIBERSORT"算法对数据集GSE28998中运动疲劳组和安静对照组进行免疫浸润分析,该方法使用反卷积方法可将归一化的基因表达矩阵转化为免疫细胞的组成。使用R包"corplot"、"vioplot"、"ggplot2"和"glment",对CIBERSORT的结果进行可视化。以骨骼肌疲劳和氧化应激为关键词在GeneCards数据库进行检索,筛选骨骼肌疲劳靶点和氧化应激靶点,通过瑞士靶点预测数据库检索CBD靶点。通过R包"UpSet"对筛选到的数据集GSE28998的差异基因、骨骼肌疲劳靶点、氧化应激靶点与CBD靶点进行基因交集分析。将交集基因加载到STRING网站进行PPI(Protein-Protein Interaction Networks,PPI)分析,利用Cy确认细节toscape软件中CytoHubba内置的五种算法(Eccenttrieity算法、EPC算法、Degree算法、MCC算法和Botterneck算法)对PPI蛋白网络分析结果进行枢纽基因的筛选。将获得的枢纽基因在GSE28998数据集中进行验证,同时利用Superman统计方法将枢纽基因与免疫细胞进行免疫浸润相关性分析,P<0.05为显著性相关,P<0.01为极显著相关,并绘制相关性热图。在Pub Chem化合物数据库中获得了CBD的分子结构,蛋白质分子结构从AlphaFold蛋白质数据库下载,利用Auto Duck Tools软件将CBD分子结构设置为配体,将蛋白分子结构设置为受体进行分子对接。将蛋白质和配体文件准备好,然后转换为PDBQT格式,去掉所有水分子,并且添加极性氢原子,网格框居中以覆盖每个蛋白质的结构域并适应自由分子运动。将对接口袋设置为30|×30A×0.05nm的方形口袋。利用CHIR-99021OpenBabel将PDBQT格式转换为PDB格式,利用LigPuls软件将对接结果进行可视化分析。最后利用AutoDuck将枢纽基因与CBD进行分子对接,选出潜在作用靶点。研究结果:(1)通过对GEO数据库筛选得到的GSE28998数据集进行差异基因的筛选,共有199个差异基因,其中42个基因上调,157基因下调。(2)对骨骼肌运动疲劳组和安静对照组进行免疫浸润分析,结果表明,运动疲劳组中的免疫细胞多为活化的细胞,而安静对照组多为未活化的免疫细胞。(3)利用R包”UpSet”对数据集GSE28998筛选的差异基因、骨骼肌疲劳靶点、氧化应激靶点与CBD靶点进行基因交集分析,结果共得出11个交集基因,分别为NOS3(endothelial Nitric Oxide Synthase,内皮型一氧化氮合酶)、CPT2(Carnitine Palmityl Transferase 2,肉毒碱棕榈酰基转移酶2)、SOD(Super Oxide Dismutase,超氧化物歧化酶)、 CAT (Catalase,过氧化氢酶)、 TNF(Tumor Necrosis Factor,肿瘤坏死因子)、GSH-Px(Glutathione Peroxidase,谷胱甘肽过氧化物酶)、AMPK(Adenosine 5‘-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMP依赖的蛋白激酶)、PGC1-α(Peroxisome proliferators-activated receptorγ coactivator lalpha过氧化物酶体增殖受体γ辅激活因子α)、TP53(Tumor Protein P53,肿瘤蛋白p53)、MAPK1(Mitogen-Activated Protein Kinase 1,丝裂原活化蛋白激酶)、IL-1β(Interleukin-1β,白细胞介素-1β)。(4)对上述11个基因进行PPI分析和CytoHubba五种算法的筛选,得出AMPK、PGC1-α、SOD、CAT、GSH-Px5个枢纽基因。(5)将筛选获得的5个枢纽基因在GSE28998数据集中进行验证,结果发现,除CAT基因外,其他基因在运动疲劳组与安静对照组之间在不同程度上均存在显著差异。(6)将获得的枢纽基因进行免疫浸润相关性分析,结果表明,GSH-Px与NK细胞、活化肥大细胞、B记忆细胞具有相关性;CAT与B记忆细胞具有相关性;PGC1-α与浆细胞具有相关性。(7)将5个枢纽基因与CBD进行分子对接,结果发现,CBD与SOD、CAT、GSH、AMPK、PGC1-α都可进行分子对接,但与AMPK、PGC1-α两个蛋白结合能最高,表明AMPK、PGC1-α可能是CBD影响骨骼肌氧化应激的主要靶点。研究结论:通过本研究,将GEO数据库中符合筛选标准的数据集GSE28998纳入研究之中,筛选其中的差异基因,共获得199个差异基因;将差异基因与骨骼肌疲劳靶点、氧化应激靶点和CBD靶点进行交集分析,获得11个交集基因;对交集基因进行PPI处理和Cytoscaoe五种算法分析,筛选出5个枢纽基因;随后将获得的5个枢纽基因进行数据集验证和免疫浸润相关性分析,最后与CBD进行分子对接,结果显示CBD可能通过AMPK、PGC1-α、SOD、CAT、GSH-Px几个靶点干预骨骼肌疲劳的氧化应激。