发酵肉是天然生物活性肽良好来源,有学者已在发酵肉中发现抗氧化和降血压活性肽。目前关于发酵肉中生物活性肽的研究主要集中在直接从产品中分离提取、活性评价以及结构的鉴定,但关于发酵剂在发酵肉中富集生物活性肽以及形成机制尚不清楚。针对该问题,本研究首先从传统发酵肉中筛选出高蛋白酶活性发酵剂-凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase negative staphylococci,CNS),旨在获得富集抗氧化和抗炎多肽的肉品发酵剂,然后对其进行全基因测序,从基因组层面揭示发酵剂水解蛋白质的遗传基础;其次以香肠为发酵肉模型,探究发酵剂在香肠发酵过程中富集抗氧化和抗炎多肽形成的机制,并通过体外模拟胃肠道消化追踪抗氧化和抗炎活性的稳定性;最后以血管内皮细胞EA.hy926为氧化应激和炎症模型,研究多肽对血管内皮细胞氧化应激和炎症的保护作用,为实现发酵剂调控发酵肉中特定活性肽的生成提供理论支持,为高生物活性发酵肉制品的开发提供菌种资源。主要研究内容及结果如下:(1)为获得高蛋白酶活且具有产肽潜力的肉品发酵剂,以蛋白水解能力以及肉品发酵剂标准为评价指标从贵州传统的发酵肉中筛选出9株具有蛋白水解能力的菌株,包括QB7、WH17、QB15、KF2、ZF4、KX8、QB11、ZF17、KX19。其中,菌株QB7蛋白水解能力最强;通过VITEK 2 Compact及其配套CBC鉴定卡和16S r DNA鉴定其为模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans,S.simulans QB7),具有耐受6.5%的Na Cl和150 mg/kg的Na NO_2、无毒力基因、不溶血、无脱羧酶、无脱氧核糖核酸酶活性和无生物膜形成能力等特点。S.simulans QB7发酵猪肉蛋白显著增加蛋白水解度(Degree of hydrolysis,DH)、多肽的浓度、清除2,2-二苯基-1-苦基肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl,DPPH)自由基的能力和还原力(p<0.05),增加对血小板活化因子-乙酰水解酶(Platelet-ac-tivating factor-acetylhydrolase,PAF-AH)的抑制率。表明S.simulans QB7是一株优良的、符合肉品发酵剂标准并且具有产肽潜力的肉品发酵剂。(2)为在基因组层面阐明发酵剂水解蛋白的遗传基础,对S.simulans QB7进行全基因测序,通过Sigana P信号肽预测胞外蛋白酶的种类多样性,并通过基因注释预测胞外蛋白酶的功能多样性。结果表明,S.simulans QB7的全基因组由一个环状染色体和5个质粒组成。GC含量为36.04%,编码基因2487个,编码基因总长度为2318760 bp。S.simulans QB7基因编码4种不同类型的蛋白酶,包括82种金属蛋白酶、28种丝氨酸蛋白酶、10种半胱氨酸蛋白酶和10种天冬氨酸蛋白酶,蛋白酶主要分布在11个金属蛋白酶家族、4个丝氨酸蛋白酶家族和2个天冬氨酸蛋白酶家族。S.simulGSK126说明书ans QB7基因编码18种具有信号肽的蛋白酶,包括3种金属蛋白酶(M15家族)、10种丝氨酸蛋白酶(S11家族)和5种半胱氨酸蛋白酶(C15家族)。(3)为探究S.simulans QB7能否适应发酵肉基质发挥最大的蛋白酶活降解蛋白生成活性肽,首先优化S.simulans QB7产酶条件,然后对S.simulans QB7主要的胞外蛋白酶进行分离纯化及酶学性质研究。结果表明,最优产酶条件为:接种量10%,初始pH为6.5,发酵温度32℃,培养时间36 h,转速160 rpm。胞外蛋白酶在温度20～60℃、pH为3～8条件下酶活性较为稳定,金属离子Na~+、Mg~(2+)、Ca~(2+)和Zn~(2+)在5和10mmol/L浓度下均显著增加蛋白酶活性(p<0.05)。其中,Ca~(2+)对酶活性影响最明显,而Cu~(2+)、Co~(2+)、Fe~(2+)、Ba~(2+)和Fe~(3+)离子的存在,导致蛋白酶活性受到显著抑制(p<0.05)。Na~+在5和10 mmol/L浓度下,蛋白酶活性分别提高到141.60%和159.36%。金属蛋白酶特异性抑制剂(o-phenanthroline,o-P)导致蛋白酶失去约75%的活性,而丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂(Phenylmethylsulfonyl fluoridSchmidtea mediterraneae,PMSF)导致蛋白酶失去约60%的活性;经LC-MS/MS鉴定S.simulans QB7胞外蛋白酶为金属蛋白酶。(4)为进一步探究发酵肉中抗氧化和抗炎多肽的形成与S.simulans QB7的关系,解析S.simulans QB7水解蛋白产生活性肽的切割位点,以香肠为发酵肉模型,接种S.simulans QB7发酵香肠,通过体外化学法结合细胞法评估S.simulans QB7发酵对香肠中多肽抗氧化和抗炎活性的影响,并探究接种后香肠中微生物群落、氨基酸和脂肪酸含量的变化。结果表明,与未接菌组相比,接种S.simulans QB7显著增加肽浓度、清除DPPH自由基的能力和还原力(p<0.05)。此外,随着成熟时间的延长,多肽活性先增加后减少,在第16 d时,抗氧化和抗炎活性最强。对活性较高的样品进一步通过EA.hy926细胞模型评价抗氧化和抗炎活性,接种S.simulans QB7显著降低肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor alpha,TNFα)诱导EA.hy926细胞中丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和超氧化物的水平(p<0.05),以及显著抑制炎症因子环氧合酶2(Cyclooxygen-ase 2,COX2)和血管细胞黏附分子-1(Vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)蛋白的表达(p<0.05)。肽谱分析结果表明S.simulans QB7水解蛋白产生抗氧化和抗炎多肽优先水解K、L、G和R氨基酸与其他氨基酸形成的肽键。同时,接种S.simulans QB7显著抑制有害细菌(p<0.05),显著增加乳酸菌(Lactic acid bacteria,LAB)、葡萄球菌数和氨基酸含量(p<0.05)。此外,S.simulans QB7有利于风味氨基酸(Ala、Glu、Try和Lys)的形成,并促进饱和脂肪酸的降解。(5)为分析S.simulans QB7发酵香肠产生的抗氧化和抗炎多肽抵抗胃肠道消化能力,对活性较高的样品进行体外模拟胃肠道消化研究,以血管内皮确认细节细胞EA.hy926为氧化应激和炎症模型研究其对血管内皮细胞抗氧化和抗炎活性的影响。经胃肠道消化后,氨基酸Arg、Ser和Glu含量不变;氨基酸Thr、Tyr和Met的含量显著增加(p<0.05)。对TNFα诱导EA.hy926细胞中MDA和超氧化物的影响效果显著低于未消化之前的样品(p<0.05),而消化前后样品均显著抑制TNFα诱导EA.hy926细胞中COX2和VCAM-1蛋白的表达(p<0.05),并且对VCAM-1蛋白的表达在经胃肠道消化后抑制作用明显增强(p<0.05),但对COX2的表达与未消化之前相比无显著变化(p>0.05)。