脂肪酶(EC 3.1.1.3)能催化油脂水解,生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。基于良好的立体选择性、有机溶剂耐受性和底物耐受性,来源于南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶B(CALB)被广泛应用于对映异构体药物拆分、功能性酯类与生物柴油合成。CALB工业化应用中(如,催化甘油和碳酸二甲酯合成碳酸甘油酯),较高的反应温度有助于传购买PF-6463922质和产物合成效率。因此,开发高热稳定性的CALB一直是国内外研究的热点。为了提高CALB的热稳定性,本研究通过脯氨酸扫描和共识序列(consensus sequence)改造提高了C.antarctica LF058来源的CALB的热稳定性,并通过表达元件和发酵条件优化提高了其在Aspergillus niger AG11-PK中的表达水平。主要研究结果如下:(1)脯氨酸扫描和共识序列改造提高CALB的热稳定性首先基于Rosetta Cartesian＿ddg脚本对CALB进行脯氨酸扫描,选择折叠自由能降低最多的8个突变体在大肠杆菌中表达和酶学性质表征,获得稳定性提升的突变体S31P和K98P。与野生型CALB相比,S31P和K98P在50℃处理5 min后的残余酶活分别提高4.4%和8.5%。将CALB与48条不同来源的脂肪酶序列进行比对获得共识序列,将显著提升CALB序列保守性的14个突变体在大肠杆菌中表达,并测定其酶学性质。其中,获得热稳定性提升的突变GDC-0068浓度体I87V、G114A、A148G、T159A和A284N的残余酶活较野生型分别提高了10%、10.1%、2.6%、10.5%和13.4%。将上述正向突变体进行组合,获得了高稳定性突变体A284N/G114A(CALBm-E)。与野生型CALB相比,CALBm-E在50℃下的半衰期提高了74.7%,达到14.5min;但后者比酶活(16.1 U·mg~(-1))和k_(cat)/K_m(5932.3 m M·min~(-1))分别较前者下降了36.3%和23%。分子动力学模拟表明,增加的疏水相互作用和氢键可能提升了CALBm-E蛋白分子的整体刚性,是其稳定性提高的主要原因。(2)表达元件优化提高CALB在A.niger中的表达以P_(bgl)(A.niger来源的β-葡糖苷酶启动子)为启动子构建CALB基因表达框。以上述载体为模板,通过PCR扩增得到包含CALB基因表达框和潮霉素抗性基因(hyg B)的基因片段P_(bgl)-calb-hyg B。将P_(bgl)-calb-hyg B转化A.niger AG11,获得基因组随机整合CALB基因的重组菌。在30℃下发酵96 h,胞外酶活为2.7 U·m L~(-1)。SDS-PAGE和Western Blot分析表明,A.niger表达的CALB分子量为38 k Da。为提高CALB表达水平,分别采用诱导型(P_(gla A)、P_(amy A)和P_(amm A))和组成型(P_(mbf A)、P_(pki A)和P_(gpd A))启动子替换P_(bgl)。其中,以P_(gla A)为启动子获得CALB表达量最高(3.42 U·m L~(-1)),较优化前增加22.4%。基于最佳的启动子条件下,将A.niger AG11糖化酶N端前部分(50-500)和全部氨酸序列融合至CALB的N-端。其中,融合糖化酶前500个氨基酸的CALB表达量达到11.2 U·m L~(-1),较优化前提高226.2%。基于CRISPR-Cas9系统,将优化后的CALB表达框分别定点整合至A.niger AG11-PK(非同源末端修复基因kus缺失菌株)基因组的amy A,amm A和bgl位点。其中,amy A位点获得CALB表达量达到17.7U·m L~(-1),较优化前提高了58%。(3)A284N/G114A在A.niger中的表达及酶学性质分析基于CRISPR-Cteaching of forensic medicineas9系统,将融合最佳表达元件的A284N/G114A基因整合至AG11-PK中的amy A位点;得到的重组A.niger发酵96 h,CALBm-A活力为18.7 U·m L~(-1)。为提高CALBm-A的表达水平,优化了重组A.niger发酵条件。在最佳条件下(接种量10%,发酵温度32℃,p H 5.5时),CALBm-A酶活达到22.4 U·m L~(-1),较优化前提高19.8%。在此基础上,确定了最佳培养基组成为:玉米淀粉20 g·L~(-1),麦芽提取物30 g·L~(-1),玉米浆:牛肉膏=1:2(总添加量为30 g·L~(-1)),吐温80 0.15%。在此培养基条件下,CALBm-A酶活达到34.8 U·m L~(-1),较优化前提高了55.4%。进一步分析了A.niger表达的野生型CALB和A284N/G114A(CALBm-A)酶学性质差异。结果显示,CALBm-A在50℃下的半衰期(t_(1/2))和熔解温度(T_m)分别达到54.7 min和59.6℃,分别较野生型CALB提高91.9%和1.8℃;然而,CALBm-A的K_m值(15.3m M)增加了28.8%,k_(cat)/K_m(7810 m M·min~(-1))降低了21.4%。