目的:肝脏是氟暴露致机体损伤的重要靶器官,但氟致肝脏损伤的详细机制仍有待研究。本课题通过体内、外实验探究线粒体活性氧(mitochondrial reactive oxygen species,mtROS)、自噬和铁死亡在氟化钠(sodium fluoride,NaF)致肝损伤中的作用,尤其是mtROS介导的自噬和铁死亡在此过程中的机制,从而为地方性氟中毒致肝脏损伤的防控提供科学依据。方法:体内实验:将48只成年Sprague-Dawley(SD)大鼠(二月龄,体重为180-250 g)随机分为四组:一个对照组(水氟浓度低于1 mg/L)和三个染毒组(25、50和100 mg/L NaF组),每组12只,各组大鼠均通过自由饮水的方式摄入NaF。染毒2个月后,处死所有大鼠,取出肝脏。通过western blot法检测大鼠肝脏组织中铁死亡关键蛋白谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(acyl-Co A synthetase long chain family member 4,ACSL4)、铁蛋白重链1(ferritin heavy chain 1,FTH1)和转铁蛋白受体(transferrin receptor,TFRC),以及自噬关键蛋白微管相关蛋白轻链3(membrane-type microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)和(sequestosome 1,SQSTM1/p62)的表达水平。体外实验:构建不同剂量的NaF染毒大鼠肝细胞(BRL3A)模型(0、20、40和60 mg/L NaF),此外,使用铁死亡抑制剂(ferrostatin-1,Fer-1)、自噬激动剂雷帕霉素(rapamycin,RAPA)和mtROS抑制剂(Mito-TEMPO)提前处理BRL3A细胞1 h后,NaF染毒24 h。通过western blot法检测BRL3A细胞内GPX4、ACSL4、FTH1、TFRC、LC3、p62和线粒体外膜受体亚基TOM20同源蛋白(mitochondrial import receptor subunit TOM20 homolog,TOMM20)蛋白的表达水平。m RFP-GFP-LC3双荧光标记法检测自噬流。JC-1荧光探针、Mito SOX Red线粒体超氧化物荧光探针和Ferro Orange荧光探针分别检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential,MMP)、mtROS和Fe~(2+)。通过分光光度法检测谷胱甘肽(glutathione,GSH)、超氧化物歧化酶(superPractice management medicaloxide dSAHA纯度ismutase,SOD)和丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量。结果:体内实验:1.NaF对大鼠肝脏铁死亡的影响:与对照组相比,100 mg/L NaF组中GPX4和FTH1表达水平降低(P<0.05),ACSL4和TFRC表达水平增加(P<0.05)。2.NaF对大鼠肝脏自噬流的影响:与对照组相比,100 mg/L NaF组中LC3-Ⅱ和p62的表达也显著增加(P<0.05)。体外实验:1.NaF对BRL3A细胞铁死亡的影响:Western blot结果显示,与对照组相比,60 mg/L NaF组中GPX4和FTH1的表达下降,ACSL4和TFRC的表达增加(P<0.05);Ferro Orange荧光探针染色后,与对照组相比,60 mg/L NaF组Fe~(2+)的含量也增加(P<0.05);同时,GSH和SOD的含量减少,而MDA的含量增加。2.NaF对BRL3A细胞自噬流的影响:Western blot结果显示,与对照组相比,60 mg/L NaF组中LC3-Ⅱ和p62的表达增加(P<0.05);m RFP-GFP-LC3双荧光结果显示,与对照组相比,60mg/L NaF组中代表自噬溶酶体的红色荧光斑点数量减少,代表自噬体的黄色荧光斑点数量增加(P<0.05)。3.NaF对BRL3A细胞线粒体的影响:JC-1荧光探针检测MMP的结果发现,NaF暴露诱导BRL3A细胞MMP下降(P<0.05);此外,Mito SOX Red荧光探针定位mtROS发现,NaF导致BRL3A细胞中mtROS显著增加(P<0.05);同时,与对照组相比,60mg/L NaF组TOMM20的表达明显增加(P<0.05)。4.RAPA对BRL3A细胞自噬流的影响:Western blot结果显示,与NaF组相比,RAPA与NaF联合干预组中LC3-Ⅱ的蛋白表达增加、p62的蛋白表达减少(P<0.05);此外,m RFP-GFP-LC3双荧光标记法发现红色荧光斑点数量增加,黄色荧光斑点数量减少。5.RAPA对BRL3A细胞铁死亡的影响:与NaF组相比,RAPA与NaF联合干预组中GPX4的蛋白表达升高、ACSL4的蛋白表达降低(P<0.05);细胞内Fe~(2+)的含量显著减少;GSH和SOD的含量增加,MDA的含量减少。6.Fer-1对BRL3A细胞铁死亡的影响:Western blot结果显示,与NaF组相比,Fer-1与NaF联合干预组中GPX4的蛋白表达增加、ACSL4的蛋白表达减少(P<0.05);细胞内Fe~(2+)的积累减少;同时,GSH和SOSBE-β-CD临床试验D的含量增加,MDA的含量减少。7.Fer-1对BRL3A细胞自噬流的影响:与NaF组相比,Fer-1与NaF联合干预组中LC3-Ⅱ和p62的蛋白表达均下降(P<0.05);同时,红色荧光斑点数量增加,黄色荧光斑点数量减少。8.Mito-TEMPO对BRL3A细胞铁死亡的影响:Western blot结果显示,与NaF组相比,Mito-TEMPO与NaF联合干预组中GPX4表达增加,ACSL4表达减少(P<0.05);细胞内Fe~(2+)的含量降低;同时,GSH和SOD的含量增加,MDA的含量减少。9.Mito-TEMPO对BRL3A细胞自噬流的影响:与NaF组相比,Mito-TEMPO与NaF联合干预组中LC3-Ⅱ和p62表达水平均下降(P<0.05);红色荧光斑点数量增加,黄色荧光斑点数量减少。结论:NaF诱导的大鼠肝脏和BRL3A细胞自噬流阻滞和铁死亡存在相互作用,且该过程受到mtROS调控,最终导致肝损伤。