研究背景:Ⅰ型高脂蛋白血症,也称为家族性乳糜微粒血症综合征(FCS)或家族性脂蛋白脂肪酶(LPL)缺乏症,是一种罕见的常染色体隐性遗传病。Ⅰ型高脂蛋白血症的患病率约为百万分之一,在法protective immunity国、加拿大、非洲等种族群体中,这种疾病的发病率会更高。Ⅰ型高脂蛋白血症的特点是由于乳糜微粒水解受损导致其大量积累,血浆中甘油三酯(TG)水平极高(>880 mg/dL或10 mmol/L)。该疾病的临床特征是反复发作的腹痛和胰腺炎、肝脾肿大、黄色瘤(特别多见于受压部位及伸肌表面)、视网膜质斑,多脂肪饮食可使血循环的乳糜微粒积聚从而使症状、体征加重。临床体征和症状通常出现在新生儿期/婴儿早期,包括发育不良、爆发性黄瘤、肝肿大、视网膜脂血症、严重和反复腹痛。其中,急性胰腺炎是该期最严重的临床表现。研究发现参与调节血浆脂质代谢的五个基因发生突变后会引起高甘油三酯血症,即脂蛋白脂肪酶基因(LPL)、载脂蛋白A-V基因(APOA5)、载脂蛋白C-Ⅱ基因(APOC2)、糖基磷脂酰肌醇锚定高密度脂蛋白结合蛋白1基因(GPIHBP1)、脂肪酶成熟因子1基因(LMF1)。LPL基因编码脂蛋白脂肪酶,脂蛋白脂肪酶催化富含TG的脂蛋白的水解;APOA5基因编码载脂蛋白A-V,载脂蛋白A-V可稳定脂蛋白-LPL复合物;APOC2基因编码载脂蛋白C-Ⅱ,载脂蛋白C-Ⅱ是LPL发挥作用必不可少的活化剂;GPIHBP1基因编码糖基磷脂酰肌醇锚定的高密度脂蛋白结合蛋白1,该蛋白可以介导LPL跨膜转运和结合;LMF1基因编码脂肪酶成熟因子1,脂肪酶成熟因子1参与LPL的折叠和表达。其中,LPL基因突变引起的高脂血症占所有I型高脂蛋白血症患者中报道的突变的大多数。人类LPL基因在8号染色体的短臂上,长度约30kb,由10个外显子组成,编码含有475个氨基酸的蛋白质LPL。LPL是一种具有甘油三酯脂肪酶活性的酶,它参与富含甘油三酯的脂蛋白颗粒中所含脂质的分配。活化后的LPL是一种非共价二聚体,具有由丝氨酸、天冬氨酸、组氨酸组成的催化三联体。LPL主要在心脏、骨骼肌和脂肪组织中合成,然后转运至血管内皮细胞的表面。细胞分泌后,二聚体的形成是LPL活性的关键步骤。到目前为止,已经报道的LPL基因突变已经超过200种,这些突变主要通过干扰分泌、与肝素结合或酶促活性来影响LPL的活性,但是目前的大多数研究主要通过软件预测基因突变的影响,仅对少数突变进行了导致高脂血症发病的机制评估。研究目的:本研究通过对两个I型高脂蛋白血症家系中先证者及其家系成员LPL基因突变的检测,进而进行体外功能实验探讨脂蛋白脂肪酶缺乏引起I型高脂蛋白血症的潜在分子学机制。研究方法:我们对两个患有I型高脂蛋白血症的家系进行了系统的临床特征和遗传学分析。在禁食过夜的情况下采集所有家系成员的肝素前血浆,然后静脉注射肝素(60IU/kg),10分钟后从对侧手臂采集肝素后血液。所有成员的肝素前血浆外周血标本通过提取基因组DNA进行全外显子基因测序,肝素后血浆用于LPL酶活性分析。将测序结果与基因组序列进行比较、分析,找出突变位点,构建包含LPL基因的野生型及突变型pcDNA3.1(+)质粒。然后,将野生型或突变型LPLpcDNA3.1(+)质粒瞬时转染人胚胎肾HEK-293T细胞进行体外研究:提取细胞裂解物和浓缩细胞培养基后,在细胞裂解物或培养基中分析LPL的产生量和酶活性。研究结果:1、家系资料:先证者1,女性,24岁时因“急性出血性坏死性胰腺炎”住院,在住院期间接受“手术”治疗,术后仍有间歇性腹痛,长期服用“胰酶”等药物治疗。25岁时,该患者初次发现其血清TG水平显著升高(约17 mmol/L),曾多次到多家医院就诊,在诊治过程中服用过多种降脂药物(包括非诺贝特、瑞舒伐他汀、中药等),但服药后TG水平均进一步升高。近年来,该患者停药后其TG 水平始终波动在13.63-33.94 mmol/L,血胆固醇(TC)水平波动在4.92-10.51mmol/L。该患者35岁时因“腹痛”住院,期间被诊断为糖尿病。糖尿病发病初期无明显高血糖症状(口干、烦渴、多尿等),该患者曾口服二甲双胍进行降血糖治疗,空腹血糖维持在5.2～8.9 mmol/L后自行停药。其49岁时出现明显高血糖症状,当时测空腹血糖15.22 mmol/L,口服中药汤剂后出现呕吐、腹泻。体格检查:腹胀,上腹部压痛,无反跳痛或墨菲征,双下肢无水肿。实验室检查:空腹血糖(11.81mmBemcentinib化学结构ol/L)和糖化血红蛋白(11.7%)高于正常参考范围;血尿淀粉酶在正常范围内;中性粒细胞计数(7.28×109/L)和红细胞沉降率(25mm/h)高于正常参考范围;TG(15.66mmol/L)和TC(7.45mmol/L)高于正常参考范围;高密度脂蛋白胆固醇(0.54mmol/L)、低密度脂蛋白胆固醇(0.72mmol/L)和载脂蛋白A(0.94g/L)高于正常参考范围。血管超声:颈动脉和下肢动脉动脉粥样硬化。腹部CT:胰腺形状不规则;肝脏形状和大小正常,实质未见异常密度影;肝内外胆管未见扩张;胆囊形状和大小正常,胆囊未见异常密度影;脾脏形状和大小正常;建议增强扫描(患者拒绝)。先证者1经皮下胰岛素泵降血糖(胰岛素剂量37u/d.kg 49.7 kg)治疗后,空腹和餐前血糖维持在4.7-6.1mmol/L,餐后2h血糖维持在6.4-11.7mmol/L,但 TG(31.85-33.57 mmol/L)和TC(9.18-10.14)水平仍升高。出院后,患者继续应用胰岛素和保肝药物治疗。两个月后,空腹和餐前血糖波动在4.8-6 mmol/L,餐后血糖在8 mmol/L左右,TG降至15.18mmol/L,TC降至5.47mmol/L,期间应用甘精胰岛素(晚上6u)皮下注射和赖脯胰岛素(早3u,中3u,晚3u)三餐前5-10分钟皮下注射控制血糖。此后,一直坚持低脂饮食,逐渐停止应用胰岛素和保肝药。2020年6月末次随访时,TG、TC、空腹血糖分别为15.37mmol/L、9.43mmol/L、6.01mmol/L。家族史:患者父母及姐姐均已去世,无法检测;姐姐曾患有复发性胰腺炎。先证者2在9个月大时因体检发现血样呈严重脂血症来我院就诊。入院第二天测TG 20.35mmol/L,TC 8.89mmol/L,经过低脂饮食和连续静脉输注小剂量胰岛素降低血脂3天后,TG 为 22.77mmol/L,TC 为 7.60mmol/L。7 天后 TG 为 12.32mmol/L,TC 为4.55mmol/L。10天后,TG为10.25mmol/L,TC为4.93mmol/L。先证者血脂明显好转后出院,出院后继续低脂饮食,没有特别不适。2020年6月末次随访,TG为3.35mmol/L,TC为2.72mmol/L,空腹血糖为5.60mmol/L。家族史:父母目前身体均健康。2、全外显子基因测序结果:经过测序和序列比对分析,发现先证者1携带一种新的LPL复合突变(c.3G>C和c.835_836delCT),这可能导致截断突变(p.M1?)和移码突变(p.L279Vfs*3)。其儿子和女儿携带p.M1?突变,但他们的血脂水平和其他表型均正常。先证者2也携带一种LPL的新型复合突变(c.188C>T和c.662T>C),分别导致编码蛋白质的第63个氨基酸从丝氨酸变为苯丙氨酸(p.Ser63Phe)和编码蛋白质的第221个氨基酸从异亮氨酸到苏氨酸(p.Ile221Thr)。先证者2的父母各携带一个突变,根据其父母携带突变情况可推测p.Ser63Phe突变来自父亲,p.Ile221Thr突变来自母亲,但到目前为止父母身体均健康。其他外显子测序未发现突变位点。3、生物信息学分析:四种新发突变所在位置在不同物种中蛋白质序列上的保守性,均为高度保守。致病性分析显示四种新发突变的致病性较强。4、致病机制研究结果:与对照组(1.6889 mU/mL)相比,患者1(0.4207mU/mL)和患者2(0.7213mU/mL)的肝素后LPL活性分别降低了75.09%和57.29%。先证者1的儿子和女儿、先证者2的父母的肝素后LPL活性和对照BAY 73-4506半抑制浓度组之间无显著差异。两种LPL的新型复合变体会引起患者血浆中LPL酶活性的变化,导致甘油三酯代谢缺陷,从而使血清甘油三酯极度升高。为了探索新鉴定的LPL突变在蛋白质水平上的影响,我们将野生型(pcDNA3.1-LPL-WT)和突变型(pcDNA3.1-LPL-MU)质粒瞬时转染到HEK293T/17细胞中。p.M1?转染组、p.L279Vfs*3转染组、p.M1?和p.L279Vfs*3共转染组细胞裂解物中几乎没有发现LPL蛋白质产生。与pcDNA3.1-LPL-WT质粒转染的细胞相比,p.S63F质粒或两种突变质粒(p.S63F和p.I221T)共转染的细胞LPL合成无显著差异,但p.I221T转染的细胞中LPL合成减少了 48.33±1.78%。HEK 293T/17培养基中的LPL活性:野生型LPL质粒转染的细胞培养基作为阳性对照,除了p.L279Vfs*3,转染pcDNA3.1-LPL-MU质粒的细胞培养基中LPL活性显著降低。具体来说,用p.M1?质粒或含两种变体(p.M1?和p.L279Vfs*3)质粒转染的细胞显示LPL酶活性分别减少55.93± 3.28%和59.84±4.47%,而LPL活性在用p.Ser63Phe或含两种变体(Ser63Phe+Ile221Thr)转染的HEK293T/17培养基中分别减少62.76±9.90%和63.25±10.55%。p.Ile221Thr质粒转染的细胞的培养基中显示了LPL活性的最大下降了81.56± 4.35%。结论:通过对两个Ⅰ型高脂蛋白血症家系中先证者及其家系成员LPL基因突变的检测,我们在国际上首次发现了两种新的LPL基因的复合突变(p.M1?/p.L279Vfs*3和p.S63F/p.I221T),两种突变均可导致患者LPL酶活性降低或者LPL蛋白表达量减少,从而导致LPL功能缺陷,引起Ⅰ型高脂蛋白血症。