研究背景骨质疏松症是一种常见的骨骼代谢性疾病,常见于中老年人,其主要特征是由于骨代谢失衡导致骨微结构改变,进而导致骨量减少和骨脆性增加,增加了患者发生骨折的风险。骨质疏松症已成为全球重要的公共卫生问题,是老年人死亡的重要原因之一。目前,临床上常用的抗骨质疏松药物存在很多副作用,如消化道症状、骨坏死、不典型骨折等。因此,寻找安全有效的药物一直是骨质疏松研究的热点问题。异甘草苷是一种小分子黄酮类药物,既往文献证明其具有调节糖脂代谢、抑制炎症、抗细胞凋亡等作用。但对破骨细胞目前尚未见相关研究。因此,本研究通过体内和体外实验,探究异甘草苷对破骨细胞的作用,并研究其生物学机制,为临床转化应用提供充分的理论基础。研究目的本课题旨在探究天然小分子化合物异甘草苷(Isoliquiritin,ISL)对破骨细胞的分化作用以及骨吸收功能的影响,明确异甘草苷对骨质疏松症的治疗效果,并进一步探究其作用调节机制,为骨质疏松症的预防和治疗提供新的方案。研究方法第一部分:异甘草苷对破骨细胞分化及功能的影响(1)体外实验构建破骨细胞模型。取6周龄雄性C57BL/6股骨,冲洗髓腔后以30ug/ml M-CSF诱导原代骨髓巨噬细胞BMDM,用100ug/ml RANKL刺激BMDM诱导其向破骨细胞分化,构建体外实验模型。(2)CCK-8测定异甘草苷对破骨细胞的毒性效应,并选定合适的细胞药物浓度。(3)用不同浓度异甘草苷干预破骨细胞分化过程,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色观察破骨细胞分化情况,通过Western Blot、RT-q PCR等方法检测骨吸收相关基因和蛋白功能的表达,验证异Dibutyryl-cAMP纯度甘草苷对破骨细胞分化和骨质吸收功能的影响。第二部分:异甘草苷对卵巢切除小鼠骨质疏松症的治疗作用(1)体内实验构建骨质疏松症模型。将8周龄C57BL/6雌性小鼠分为4组,分别为:假手术组(Sham group,Sham),卵巢切除组(OVX group,OVX),低剂量异甘草苷组(ISL low dose group,ISL-LD),高剂量异甘草苷组(ISL high dose group,ISL-HD)。其中,Sham仅接受假手术,OVX、ISL-LD、ISL-HD三组接受卵巢切除术构建骨质疏松症模型。(2)成功构建卵巢切除术骨质疏松症模型后,Sham组、OVX组接受PBS灌胃注射,ISL-LD、ISL-HD组分别接受20mg/kg和50mg/kg剂量的异甘草苷灌胃注射,治疗时间持续6周。(3)治疗结束后,取股骨标本行micro-CT多层扫描并重建、H&E染色、TRAP染色,比较骨密度、骨小梁厚度、骨小梁数量、破骨细胞数量等指标。在动物模型层面验证异甘草苷对卵巢摘除骨质疏松症引起骨丢失的保护作用。第三部分:异甘草苷影响破骨细胞分化及功能的机制探究(1)构建破骨细胞模型,用不同浓度异甘草苷进行干预。通过Western Blot等方法检验破骨细胞中糖酵解相关蛋白的表达,验证异甘草苷影响破骨细胞分化过程中的糖酵解代谢过程。(2)从Pub Chem数据下载异甘草苷的3D结构,将其与糖酵解相关蛋白依次使用Auto Dock进行分子对接,并对结果进行相互作用模式分析,预测异甘草苷影响糖酵解过程的具体作用靶点。(3)培养RAW264.7细胞株,不同浓度异甘草苷预处理后,用LPS刺激诱导炎症模型。通过Western Blot、RT-q PCR等方法检测炎症相关基因和蛋白功能的表达,验证异甘草苷对炎症的抑制作用。(4)用不同浓度异甘草苷预处理巨噬细胞,LPS刺激后取上清。用该上清和RANKL共同诱导BMDM向破骨细胞分化,通过TRAP染色、Western Blot等方法检测破骨细胞的分化和破骨相关蛋白表达。验证异甘草苷通过影响炎症微环境,干预破骨细胞的分化和作用功能。研究结果1、CCK-8结果显示160u M及以下浓度的异甘草苷对于BMDM没有明显的细胞毒性,未对BMDM的细胞活性产生明显影响,因此,本研究最终选用20u M和40u M作为刺激细胞的药物剂量。2、TRAP染色显示,异甘草苷明显阻碍了巨噬细胞向破骨细胞分化的过程,与对照组相比,实验组染色的破骨细胞数量和体积显著减少。对破骨细胞数量、面积进行定量分析,发现40u M的异甘草苷相对于20u M对破骨细胞分化具有更强的抑制作用。3、Western blot、RT-q PCR的结果提示,用RANKL诱导刺激BMDM向破骨细胞分化的过程中,与破骨功能相关基因和蛋白,如NFATc1、CTSK、ACP5、MMP9的表达产生了明显的提升。经异甘草苷处理后的实验组,破骨相关基因和蛋白相对于对照组产生了一定的下调。对其进行定量分析,发现20u M和40u M异甘草苷对破骨相关基因和蛋白的表达具有显著的抑制作用,且40u M的抑制作用更强。4、异甘草苷显著缓解了小鼠卵巢摘除后引起的骨质疏松症,对骨量下降起到了明显的保护作用。Micro-CT结果显示,卵巢切除造模术后6周,OVX组的小鼠股骨出现了显著的骨质丢失,定量分析后发现其骨密度、骨皮质厚度、骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁厚度不同程度的下降,并且骨小梁分离度产生上升。而在异甘草苷治疗组,小鼠以上各项骨量指标均有所逆转。同时,H&E和TRAP染色显示,OVX组小鼠可见股骨骨小梁周围破骨细胞数量明显增加。在异甘草苷治疗组中,小鼠股骨中的可见染色的破骨细胞数量明显减少,尤其在ISL-HD组中,骨小梁周围的破骨细胞数量远低于OVX组。5、用RANKL诱导刺激RAW264.7细胞株向破骨细胞分化,Western blot显示,糖酵解相关蛋白HK1、PFK、PKM、LDHA的表达均显著提升,在异甘草苷干预后,这些蛋白的表达产生了不同程度的降低。定量分析后发现,高浓度的异甘草苷对破骨细胞糖酵解相关蛋白的表达具有强烈的抑制作用。另外,使用分子对接技术将异甘草苷的分子结构与糖酵解相关蛋白依次进行分子对接,发现异甘草苷与AKR1A1通过氢键和疏水作用力结合,拥有较强的结合能,通过对接模式分析,提示AKR1A1可能是异甘草苷的药物作用靶点。6、在LPS刺激RAW264.7细胞的巨噬细胞炎症反应模型中。异甘草苷预处理后的巨噬细胞炎症相关基因表达均受到了抑制。q PCR结果显示,LPS刺激后炎症相关基因TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10的表达显著上调,但在异甘草苷预处理组中,炎症相关基因的上调则受到了抑制。Western blot结果显示,巨噬细胞在LPS的刺激下,与对照组相比,异甘草苷预处理后的炎症相关蛋白的表达明显下降,这一结果与前面RNA的表达趋势相一致。7、异甘草苷预处理和LPS刺激后的上清液,在加入RANKL共同诱导破骨细胞分化后,其TRAP染色结MG132配制果显示:异甘草苷预处理后的上清液诱导破骨细胞分化的能力与对照组相比大大减弱,产生的破骨细胞数量和体积明显减少。同时,Western blot结果显示,异甘草苷预处理之后的上清液抑制了破骨细胞的骨吸收功能,paediatrics (drugs and medicines)阻碍了破骨相关蛋白的表达,且高剂量异甘草苷处理后的上清液的抑制效果更强。研究结论异甘草苷一方面通过抑制破骨细胞糖酵解代谢过程,另一方面通过抑制炎症反应和改善炎症微环境,阻碍了破骨细胞分化和骨吸收功能,缓解了OVX诱导的骨质疏松症。并且异甘草苷可能通过结合AKR1A1实现对糖酵解的抑制作用。综上,异甘草苷可能成为治疗骨质疏松症的潜在药物。