磷酸三(1,3-二氯-2-丙基)酯(Tri(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate,TDCIPP)是一种新型的环境内分泌干扰物。随着溴代阻燃剂在全世界范围内的禁止使用,TDCIPP因其良好的阻燃效果以及低烟、低卤等特点,迅速成为了溴代阻燃剂的替换产品。研究发现,TDCIPP能通过多种机制发挥致癌性、神经毒性和生殖毒性。但是,TDCIPP对雄性生殖系统造成损伤的具体机制目前尚未阐明。铁死亡作为一种新型的死亡方式,已被证实和雄性生殖损伤之间存在相关性。本研究使用动物模型和体外细胞模型,重点探讨TDCIPP对青春期雄性小鼠的生殖损伤作用,以及铁死亡在这一致损伤过程中的作用。第一部分铁死亡参与TDCIPP所致的雄性青春期小鼠睾丸损伤目的:探究铁死亡在TDCIPP致雄性小鼠睾丸损伤中的作用。方法:选取30只健康三周龄雄性C57BL/6小鼠,体重13±2 g,适应性饲养一周后,根据随机数字表分为对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、铁死亡抑制剂组,每组6只;低、中、高剂量组小鼠分别采用5 mg/(kg·d)、25 mg/(kg·d)、125 mg/(kg·d)TDCIPP连续灌胃染毒28天,对照组采用等量玉米油灌胃处理28天,每天记录体重;铁死亡抑制剂组采用125 mg/(kg·d)TDCIPP连续灌胃28天,并且每周采用30 mg/kg甲磺酸去铁胺(Deferoxamine Mesylate,DFO)生理盐水溶液进行腹腔注射3次。处理结束后,处死小鼠,分离小鼠附睾,进行精子计数;H&E染色观察精子形态,计算精子畸形率;收集小鼠睾丸,计算小鼠睾丸脏器系数;采用H&E染色观察小鼠睾丸组织形态学变化,组织LGX818生产商铁检测试剂盒检测睾丸组织中铁离子含量;采用活性氧(ROS)试剂盒检测睾丸组织中活性氧水平,组织丙二醛(MDA)检测试剂盒检测小鼠睾丸组织中MDGW-572016A含量,增强型线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测小鼠睾丸细胞线粒体膜电位水平;Western blot检测睾丸组织内铁死亡相关蛋白GPX4、COX2蛋白表达量。结果:与对照组相比,高剂量组小鼠的体重从21天开始出现显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05),中、高剂量组小鼠睾丸组织中生精细胞排列紊乱,呈现空泡状结构,附睾中精子数量显著降低,精子畸形率显著升高(P<0.05);小鼠睾丸组织中铁离子含量以及MDA含量显著升高(P<0.001),小鼠睾丸细胞线粒体膜电位显著下降(P<0.01),铁死亡相关蛋白GPX4含量显著降低(P<0.05)、COX2含量显著上升(P<0.01);与高剂量组相比,铁死亡抑制剂组中生精细胞排列较为紧密正常,睾丸组织内ROS和铁离子含量显著降低(P<0.01);GPX4蛋白表达显著升高而COX2蛋白表达显著下降Levulinic acid biological production(P<0.05)。结论:铁死亡参与青春期TDCIPP暴露引起的雄性小鼠睾丸组织损伤。第二部分铁死亡在TDCIPP暴露致GC-2 spd细胞毒损伤中的作用研究目的:探究TDCIPP暴露对GC-2 spd细胞的影响,进一步探究铁死亡在TDCIPP暴露引起GC-2 spd细胞损伤中的作用。方法:CCK-8法检测TDCIPP对GC-2 spd细胞活力的影响,确定染毒剂量。根据CCK-8的结果,采用不同浓度的TDCIPP处理GC-2 spd细胞,用Liperfluo荧光探针检测GC-2 spd细胞内脂质活性氧水平,采用细胞铁检测试剂盒检测GC-2 spd细胞中铁离子含量;采用活性氧试剂盒检测GC-2 spd细胞中活性氧水平,细胞丙二醛(MDA)检测试剂盒检测GC-2 spd细胞中MDA含量;Western blot检测GC-2 spd细胞中铁死亡相关蛋白HO-1、GPX4、COX2蛋白以及铁自噬相关蛋白NCOA4、ATG5、LC3的表达量。结果:CCK-8结果显示,与对照组相比,TDCIPP暴露导致细胞的存活率显著下降(P<0.05),经计算确定,细胞的IC_(50)为77.00μM[95%CI 72.66,81.52],后续实验采用0、15、30、60μM作为的染毒浓度。与对照组相比,30、60μM TDCIPP染毒组细胞中脂质活性氧水平显著升高,细胞中铁离子相对含量、MDA含量以及ROS相对含量显著高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05)。Western blot检测GC-2 spd细胞中铁死亡相关蛋白的含量发现,与对照组相比,30、60μM TDCIPP染毒导致细胞内GPX4蛋白表达量显著下降,HO-1、COX2蛋白表达量显著上升,差异具有统计学意义(P<0.05)。此外,与对照组相比,30、60μM TDCIPP染毒导致细胞内NCOA4以及ATG5蛋白表达量显著上升,差异具有统计学意义(P<0.01);15、30、60μM TDCIPP染毒导致细胞中LC3Ⅱ/β-actin及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值显著上升,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:TDCIPP引起GC-2 spd细胞中铁代谢紊乱,进而诱导细胞铁死亡,并且该过程可能与TDCIPP引起的铁自噬异常有关。