背景:乳腺癌(Breast cancer)是女性最常发生的恶性肿瘤。乳腺癌分为四种分子亚型,其中三阴性乳腺癌(Triple negative breast cancer,TNBC)占15%左右,具有高转移、预后差的特性。相对于正常组织细胞,癌细胞表现出高速低效的产能方式—有氧糖酵解,即Warburg效应。丙酮酸激酶M2型(Pyruvate kinase M2Dinaciclib化学结构,PKM2)是糖酵解的第三步限速酶,也是Warburg效应的关键蛋白,其在多种肿瘤组织中高度表达。大量研究表明,肿瘤细胞糖、脂类和氨基酸间具有较强的能量代偿能力,但具体机制有待阐明。我们的前期研究发现PKM2被敲低后只是部分抑制肿瘤细胞的增殖和迁移,肿瘤细胞部分被诱导发生凋亡和自噬,肿瘤细胞也未发生严重的能量缺乏。那么,这是否与细胞的能量代偿有关?其具体分子机制如何?目的:1.探讨在三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231中敲除PKM2,阻断Warburg效应后对细胞物质代谢的影响。2.探讨在三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231中敲除PKM2,阻断Warburg效应后细胞物质代谢发生改变的可能分子机制。方法:1.基于UALCAN/TCGA数据库分析PKM2与乳腺癌发生的相关性,PKM2在各肿瘤组织中的转录水平及生存预后分析,PKM2在各乳腺癌亚型及乳腺癌发展各个阶段的表达水平。2.基于CRISPR/Cas9技术构建PKM2敲除的三阴性乳腺癌细胞株MDA-MB-231;Western blot验证PKM2的敲除效果;采用试剂盒检测PKM2敲除后细胞的PK活性、ATP含量、葡萄糖含量及乳酸生成量;CCK8实验和克隆形成实验检测PKM2敲除细胞的增殖能力;Transwell和创伤愈合实验检测PKM2敲除后细胞的迁移能力。3.代谢组学检测沉默PKM2后MDA-MB-231细胞的代selleck PF-03084014谢情况;RNA-seq检测PKM2敲除后细胞的转录组表达情况并初探敲除PKM2后物质代谢发生改变的可能分子机制。4.Lipi Dye染色、油红O染色检测脂滴及中性脂质含量;FAO Blue检测脂肪酸氧化(Fatty acid oxidation,FAO)水平;总胆固醇、甘油三酯试剂盒检测总胆固醇及甘油三酯含量。5.Western blot检测ACADVL的表达情况;免疫荧光实验进行线粒体定位与ACADVL表达水平检测;UCSC Xena数据库于m RNA水平分析乳腺癌患者PKM2与ACADVL表达相关性。6.在PKM2敲除的MDA-MB-231细胞中进一步敲低ACADVL表达后,CCK8、Ed U及创伤愈合实验检测增殖及迁移能力。7.Western blot检测ACADVL的转录因子KLF4(Krüppel-like factor 4,KLF4)及能量感受蛋白AMPK的表达;Western blot检测自噬相关蛋白LC3A/B、Beclin1的表达;观察AMPK激活剂(AICAR)和抑制剂(Compound C)对KLF4和ACADVL表达的影响。结果:1.PKM2在乳腺癌中上调表达;Kaplan-Meier分析表明PKM2高表达与较差的患者总生存期有关;PKM2在乳腺癌各亚型及疾病进展各个阶段表达水平均升高。2.Western blot检测证实MDA-MB-231细胞PKM2敲除成功,PKM2敲除后丙酮酸激酶活性下调约90%,葡萄糖摄取能力被抑制约50%,乳酸生成下降约40%,有氧糖酵解产生的ATP水平下降约50%;敲除PKM2在一定程度上减弱了MDA-MB-231细胞的增殖能力,及横向与纵向迁移能力。3.代谢组学分析结果表明敲除PKM2后细胞中的糖代谢、脂类代谢和氨基酸代谢均发生显著变化,显著差异代谢物富集于脂质分解信号通路、丙酮酸代谢及糖酵解代谢信号通路,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路及AMPK信号通路。RNA-seq结果提示PKM2敲除后共有3235个基因上调表达,3419个基因下调表达(≧2倍,调整后P<0.05),其中极长链酰基辅酶A脱氢酶(ACADVL)上调表达较为明显。差异表达显著基因KEGG分析结果表明胆固醇稳态和脂肪酸合成是下调最多的途径,脂肪酸氧化是上调较多的途径;对RNA-seq中脂质代谢相关基因进行KEGG富集分析显示,敲除PKM2使MDA-MB-231细胞“脂肪酸降解”、“脂肪酸代谢”和“代谢途径”发生紊乱。4.MDA-MB-231细胞敲除PKM2使得脂滴丰度降低及中性脂质含量下降;脂肪酸氧化水平上升;总胆固醇含量下降。5.Western blot检测表明MDA-MB-231细胞中沉默PKM2后ACADVL表达水平增加;免疫荧光检测表明定位于线粒体的ACADVL表达增加;且通过UALCAN数据库分析得到在乳腺癌中PKM2与ACADVL的m RNA水平呈负相关。6.在PKM2敲除的zoonotic infectionMDA-MB-231细胞中进一步敲低ACADVL表达后,细胞的增殖和迁移能力进一步被削弱。7.敲除MDA-MB-231细胞PKM2表达可诱导细胞发生自噬,并激活能量感受器AMPK,导致下游ACC活性被抑制,且增强ACADVL转录因子KLF4的表达;AMPK激活剂或抑制剂可增强或削弱这一作用。结论:1.在MDA-MB-231细胞中敲除PKM2,阻断Warburg效应后,细胞糖代谢、脂类代谢和氨基酸代谢均发生显著变化,其中脂肪酸的氧化分解尤甚。2.在MDA-MB-231细胞中敲除PKM2,阻断Warburg效应后通过活化AMPK-KLF4-ACADVL通路以增加脂肪酸氧化供能。