研究背景:肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC,以下简称肝癌)是全球范围内重大公共卫生问题,其高发病率和高致死性给人类和动物健康带来严重威胁。对于早期肝癌,肝功能保持良好的患者,手术切除、肝移植和肿瘤消融是肝癌治疗主要方案。然而肝癌发病隐匿,就诊时多数患者已经失去最佳手术时机。对于传统化疗药物,增加患者生存获益的同时,其耐药问题饱受诟病。近几年,针对PD-1/PD-L1和CTLA-4靶点的免疫检查点抑制剂(Immune Checkpoint Inhibitors,ICIs)疗法已经在临床试验中显示出良好的抗肝癌活性。然而,随着ICIs药物的不断发展以及药物可及性的不断提高,免疫治疗相关不良反应(immune-related adverse events,ir AEs)也逐渐被人们发现和关注。因此,丰富现有治疗手段以及开发新的治疗策略迫在眉睫。天然产物一直是药物开发的宝库,从天然药物中寻找新的抗肝癌药物,是肝癌治疗的一种重要策略。土槿皮乙酸(Pseudolaric Acid B,PAB)是从中药“土槿皮”中分离提取的一种新型二萜酸,具有抗菌、抗血管生成、抗病毒等多种生物活性。既往体外实验表明,PAB能够诱导前列腺癌、子宫颈癌和乳腺癌细胞死亡,但PAB对肝癌的抗癌作用靶点、具体分子机制和应用潜力尚不完全清楚。研究目的:(1)本研究拟通过体外细胞生物学实验以及C57BL/6J小鼠肝癌移植瘤模型实验,系统阐述PAB抑制肝癌细胞生长的相关分子机制,揭示PAB诱导肝癌细胞凋亡的具体信号分子途径。(2)探讨PAB与临床抗肝癌药物索拉非尼联合的协同作用,明确联合用药的抗肝癌效果以及安全性。奠定PAB临床前研究基础为其进一步开发和临床应用提供理论和实验依据。研究方法:细胞增殖毒性实验(CCK8)、细胞增殖实验(Ed U)以及平板克隆形成实验(CFU)检测细胞增殖;流式细胞术检测线粒体膜电位和细胞凋亡;Western blot实验检测细胞凋亡、线粒体呼吸链及线粒体分裂相关蛋白表达情况;激光共聚焦显微镜观察线粒体分裂、膜电位变化以及目标蛋白和线粒体共定位情况;透射电子显微镜观察线粒体形态结构;化学发光法检测肝癌细胞ATP含量;RNA-seq检测差异基因和通路富集情况;免疫组织化学检测肿瘤组织细胞增殖和凋亡相关蛋白表达情况;组织H&E染色检测各组小鼠主要脏器的损伤程度。研究内容和结果:(1)PAB抑制肝癌细胞增殖并诱导细胞凋亡PAB在体外能够抑制肝癌细胞增殖,降低肝癌细胞克隆形成能力,并呈现浓度依赖性,然而对人正常组织细胞(LO2和HK2)活力影响甚微。此外,通过不同死亡形式的抑制剂和PAB共孵育暗示PAB能够诱导肝癌细胞发生凋亡。流式细胞术结果证实,PAB能够诱导Hepa1-6肝癌细胞凋亡,呈现浓度依赖性。Western blot检测进一步发现PAB能够增加凋亡蛋白Cleaved-Caspase3、Cleaved-PARP、Bax表达,降低抗凋亡蛋白Bcl-2表达。(2)PAB促进Drp1(Ser616)磷酸化及线粒体转位诱导线粒体过度分裂并激活线粒体凋亡通路通过透射电子显微镜观察发现PAB处理后肝癌细胞线粒体出现肿胀变圆,线粒体嵴断裂甚至消失。激光共聚焦显微镜观察进一步发现PAB处理导致肝癌细胞线粒体过度分裂,碎片化线粒体增多并断裂成“点状”。Western blot检测发现PAB可促进Drp1(Ser 616)磷酸化及线粒体转位,但对Drp1(Ser 637)磷酸化水平未见明显影响。Drp1线粒体转位抑制剂Mdivi-1和PAB共孵育,发现共孵育后降低了Drp1(Ser 616)磷酸化水平及线粒体转位,有效抑制线粒体过度分裂,使其重新恢复分裂和融合平衡状态,肝癌细胞活力和凋亡均得到有效改善。稳定敲低Hepa1-6肝癌细胞株中Drp1表达后直接阻滞了PAB诱导的线粒体过度分裂,分裂和融合重新恢复平衡,恢复了线粒体的形态和功能,极大地减弱了线粒体凋亡途径的激活。(3)PAB激活AMPK-JNK通路在Drp1调控肝癌细胞生长和凋亡中的作用研究转录组测序分析399个基因的表达在PABITI immune tolerance induction处理后显著上调,同时1330个基因的表达显著下降。利用GSEA富集分析显示这些上调的基因主要富集在MAPK信号通路中,尤其是JNK级联相关的基因。我们通过Western blot实验验证了JNK级联相关基因编码蛋白表达量在PAB处理后上调。JNK抑制剂SP600125可明显阻断PAB诱导的Drp1(Ser 616)磷酸化,阻滞线粒体过度分裂,恢复线粒体形态结构和功能,进而阻断了PAB对线粒体凋亡通路的激活。然而,Drp1线粒体转位抑制剂Mdivi-1和PAB共孵育并没有对JNK的磷酸化水平造成明显影响。说明JNK通过作用于Drp1的上游调控细胞凋亡。同样地,我们利用AMPK抑制剂Compound C证明AMPK亦作用于Drp1上游。Western blot实验进一步说明AMPK抑制剂Compound C能够降低JNK的磷酸化水平,但是JNK抑制剂SP600125并未对AMPK的磷酸化水平造成明显影响。综上所述,PAB通过激活AMPK/JNK通路诱导Drp1(Ser 616)磷酸化,导致线粒体过度分裂,最终激活线粒体凋亡通路。(4)PAB对小鼠肝癌皮下移植瘤模型体内抗肿瘤作用研究在基于C57BL/6J小鼠构建的小鼠肝癌Hepa1-6细胞皮下移植瘤模型中。PAB能够显著抑制小鼠肝癌皮下移植瘤模型肿瘤生长,降低肿瘤组织重量,并呈现良好的剂量依赖性。免疫组织化学检测发现PAB能够降低肿瘤组织细胞增殖蛋白Ki67的表达,增加凋亡蛋白Cleaved-Caspase3的表达。与体外结果一致,PAB在体内同样能够激活AMPK/JNK/Drp1信号通路。根据体重跟踪监测,我们发现PAB对肝癌移植瘤模型小鼠体重未见明显影响。小鼠肺、肝、脾以及肾脏H&E染色和肝肾功能指标检测未见明显异常。(5)PAB联合索拉非尼协同抗肝细胞癌作用研究细胞增殖毒性实验、细胞克隆形成实验和Calcein-AAlpelisib分子式M/PI共染实验发现PAB联合索拉非尼对Hepa1-6肝癌细胞在体外具有协同杀伤效果。激光共聚焦和Western blot实验进一步说明PAB联合索拉非尼可以更加显著的激活线粒体凋亡通路诱导肝癌细胞凋亡。PAB联合索拉非尼增强单药对Hepa1-6肝癌细胞皮下移植瘤模型肿瘤生长的抑制,显著降低肿瘤组织重量,表现出协同作用。此外,免疫组织化学检测发现,PAB联合索拉非尼抑制肿瘤组织细胞增殖蛋白Ki67的表达,增强凋亡蛋白Cleaved-Caspase3的表达。根据体重跟踪监测,我们发现PAB联合索拉非尼对肝癌移植瘤模型小鼠体重未见显著影响。小鼠心、肝、脾以及肾脏H&E染色和肝肾功能指标检测未见明显异常。研究结论:(1)PAB在体外能够显著降低肝癌细胞活力,并对人正常组织细胞(LO2和HK2)无明显抑制作用,在体内能够有效抑制小鼠肝癌移植瘤生长,并未对小鼠肺、肝、VE-822体内实验剂量脾以及肾脏等主要组织器官造成损伤,小鼠体重和肝肾功能指标未见异常。(2)PAB通过激活AMPK/JNK通路诱导Drp1(Ser 616)磷酸化及其线粒体转位,打破线粒体分裂和融合平衡状态,促使线粒体过度分裂,诱导线粒体结构异常和功能障碍,进而激活线粒体凋亡通路,导致肝癌细胞凋亡。(3)PAB联合索拉非尼通过激活线粒体凋亡通路增强对Hepa1-6肝癌细胞的体外杀伤活性。(4)相较于药物单独治疗,PAB联合索拉非尼在体内具有协同抗肝癌效应。并未对小鼠心、肝、脾以及肾脏等主要脏器组织造成损伤,小鼠体重和肝肾功能指标未见明显异常。