目的:神经前体细胞表达发育下调基因4-2(neural precursor cell expressed developmentally downregulated gene 4-like,NEDD4-2)编码一种E3连接酶,可通过泛素化神经活性底物参与癫痫发作。内质网滞留蛋白1(retention in endoplasmic reticulum 1,RER1)主要表达于高尔基体顺面,能特异性识别异常蛋白跨膜结构域(tranmembrane domain,TMD)的内质网(endoplasmic reticulum,ER)滞留信号,使其回流至ER进一步组装或降解,从而影响底物蛋白的细胞膜表达水平或引发ER应激。本课题组前期构建了癫痫易感的Nedd4-2~(+/-)小鼠模型,并通过蛋白质谱筛查到Rer1在海马组织表达上调,而Rer1上调的分子机制及其通过何种底物和机制参与癫痫亟需进一步研究。本研究利用毒胡萝卜素(thapsigargin,Tg)和戊四唑(Pentylenetetrazole,PTZ)诱导评估Nedd4-2~(+/-)小鼠易感ER应激加剧癫痫发作;通过构建野生型和突变型RER1表达载体鉴定NEDD4-2介导RER1泛素化降解的基序和分子机制;通过Rer1免疫沉淀-蛋白质谱(Immunoprecipitation-Mass Spectrometry,IP-MS)筛查Nedd4-2~(+/-)小鼠和野生型小鼠海马组织中与Rer1结合能力存在差异的蛋白质,揭示可能参与癫痫的潜在Rer1底物。这可能在癫痫的治疗方面具有潜在的应用价值。方法:1.Nedd4-2~(+/-)小鼠和野生型小鼠每组4只,一次性腹腔注射ER应激诱导剂Tg(2 mg/kg)或生理盐水,观察6小时后处死小鼠,解剖分离小鼠大脑皮质和海马,Western blot检测ER应激标记物CHOP水平,免疫组化和神经元尼氏染色分析CHOP的水平和分布,分析Nedd4-2~(+/-)小鼠是否易感ER应激。2.Nedd4-2~(+/-)小鼠和野生型小鼠各分为三组,每组4只,每天连续先腹腔注射ER应激诱导剂Tg(1 mg/kg)、ER应激抑制剂salubrinal(1 mg/kg)或生理盐水,1小时后腹腔注射癫痫诱导剂PTZ(35 mg/kg),观察1小时后,评估小鼠的癫痫发作情况,按照Racine分级记录评分,分析ER应激对Nedd4-2~(+/-)小鼠癫痫等级的影响。3.上述每日腹腔注射的小鼠,当每组中有达到癫痫7级(抽搐死亡)时处死该组小鼠,Western blot检测小鼠全脑组织中ER应激标记物CHOP水平,分析Nedd4-2~(+/-)小鼠的慢性ER应激水平。4.小鼠皮质和海马组织Western blot检测Nedd4-2和Rer1的表达,免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)检测小鼠全脑组织内Nedd4-2与Rer1以及Rer1与泛素(ubiquitin,Ub)的结合作用,体内水平分析Nedd4-2介导的Rer1泛素化修饰,并分析ER应激状态对Nedd4-2介导Rer1泛素化的影响。5.培养人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y和胶质瘤细胞U251,合成三种人NEDD4-2的特异性si RNA并以0.5μg处理细胞48h,Western blot检测NEDD4-2和RER1的表达,体外水平验证NEDD4-2敲低对RER1的表达上调作用。6.构建NEDD4-2和RER1表达载体并用不同的标签标记,共转染SH-SY5Y和U251细胞,利用标签蛋白抗体Western blot检测NEDD4-2和RER1的表达,Co-IP检测二者的相互作用以及RER1与Ub的相互作用,体外水平分析NEDD4-2过表达对RER1的表达下调作用,鉴定NEDD4-2介导RER1泛素化修饰。7.共转染NEDD4-2和RER1表达载体的SH-SY5Y和U251细胞用ER应激诱导剂Tg(0.5μM)处理24h,Co-IP检测NEDD4-2与RER1的相互作用,分析ER应激对NEDD4-2介导RER1泛素化的影响。8.构建RER1的野生型和TP37＿38AA突变型表达载体,分别与NEDD4-2野生型表达载体共转染SH-SY5Y和U251细胞,Co-IP检测NEDD4-2和RER1的结合,分析NEDD4-2与RER1互作的结合基序。9.野生型/突变型RER1与NEDD4-2表达载体共转染SH-SY5Y和U251细胞36h后,施加蛋白质合成抑制剂放线菌酮CHX(100μg/ml)处理,继续培养0h、3h和6h,Western blot检测RER1表达变化,比较评估RER1结合基序突变蛋白的稳定性改变。10.共转染野生型NEDD4-2和RER1表达载体的SH-SY5Y和U251细胞36h后,施加蛋白酶体抑制剂MG132(10μM)或蛋白溶酶体抑制剂leupeptin(10μM)处理,继续培养12h,Western blot检测RER1表达变化,分析RER1的蛋白酶体或溶酶体降解途径。11.解剖分离PTZ每日腹腔注射诱导慢性癫痫的Nedd4-2~(+/-)小鼠与野生型小鼠(n=4)的海马组织,采用Rer1抗体进行IP-MS检测,比较分析海马组织中差异表达的蛋白,并进行GO、KEGG等生物信息分析。12.选择IP-MS筛查到的差异蛋白GABAA受体的α1亚基(α1 subunit of GABAA receptor,Gabra1),提取小鼠全脑组织蛋白,Co-IP检测Rer1与Gabra1的相互作用,验证Gabra1为Rer1的ER滞留底物。13.Nedd4-2~(+/-)小鼠和野生型小鼠全脑组织蛋白加入ER特异性糖苷酶Endo-H(0.5U/ml)于37℃消化1h,Western blot检测Gabra1条带的分子量变化,以分子量降低的Gabra1代表ER滞留的Gabra1,分析Nedd4-2~(+/-)小鼠全脑组织Gabra1的ER滞留情况。结果:1.基础条件下(生理盐水腹腔注射)的Nedd4-2~(+/-)小鼠和野生小鼠的皮质和海马中均未检测到CHOP表达,而在Tg处理的Nedd4-2~(+/-)小鼠和野生小鼠中均检测到CHOP表达,且Nedd4-2~(+/-)小鼠的CHOP水平显著高于野生型小鼠,提示Nedd4-2~(+/-)小鼠ER应激水平升高。2.小鼠脑切片免疫组化显示Nedd4-2~(+/-)小鼠皮质和海马中的CHOP染色信号比野生型对照组强,联合尼氏染色体提示ER应激标记物CHOP主要定位于神经元。3.Tg、salubrinal或生理盐水预处理PTZ诱导慢性癫痫的小鼠,三组预处理因素的Nedd4-2~(+/-)小鼠癫痫Racine评分均高于野生型小鼠;其中Tg预处理小鼠的癫痫评分显著高于salubrinal和生理盐水组(P<0.05),并于第6天有小鼠达到癫痫7级;salubrinal和生理盐水预处理的小鼠癫痫评分较低,分别于第13天和第12天达到7级,提示ER应激加剧了Nedd4-2~(+/-)小鼠的癫痫表型。4.上述小鼠全脑组织Western blot检测CHOP表达均呈阳性,且Nedd4-2~(+/-)小鼠CHOP水平相对高于野生型小鼠,Tg预处理组小鼠CHOP升Galunisertib使用方法高最为显著。5.PTZ诱导的Nedd4-2~(+/-)小鼠皮质和海马组织Nedd4-2表达下降约一半,而Rer1表达较野生型对照组小鼠显著增加约1.7倍;Co-IP结果显示,与野生型对照组相比,Nedd4-2~(Community-Based Medicine+/-)小鼠全脑组织中Rer1的泛素化水平下调(P<0.01);Nedd4-2与Rer1存在相互作用,二者的相互作用于NedMRTX849研究购买d4-2~(+/-)小鼠下降至野生型小鼠的60%左右(P<0.01),提示Nedd4-2~(+/-)小鼠Nedd4-2单倍剂量不足使Rer1泛素化降解减少,Rer1表达升高。6.Tg诱导ER应激的小鼠Nedd4-2与Rer1相互作用增强,该效应于野生型小鼠更明显,提示Nedd4-2~(+/-)小鼠对Tg的反应性相对较低。7.si RNA敲低SH-SY5Y和U251细胞的NEDD4-2,RER1表达相应增加,与对照组相比,敲除效率高的si RNA RER1表达升高显著。8.SH-SY5Y和U251细胞共转染NEDD4-2和RER1表达载体,Western blot显示NEDD4-2过表达使RER1表达显著降低;RER1的泛素化水平升高;Co-IP显示NEDD4-2与RER1存在相互作用,且Tg处理的共转染细胞使二者的相互作用增强,提示NEDD4-2介导的RER1泛素化降解呈ER应激反应性。9.SH-SY5Y和U251细胞共转染NEDD4-2和野生型/突变型RER1表达载体,Co-IP显示TP37＿38AA突变型RER1与NEDD4-2的相互作用明显减弱(P<0.01);CHX处理阻断蛋白质合成,Western blot显示突变型RER1比野生型RER1维持更高的表达水平(P<0.01),提示NEDD4-2介导RER1泛素化可能通过~(36)STPY~(39)基序。10.SH-SY5Y和U251细胞共转染野生型NEDD4-2和RER1表达载体,Western blot检测提示NEDD4-2降低RER1表达,MG132处理可部分逆转RER1的表达降低,而leupeptin处理没有逆转作用,提示NEDD4-2介导RER1泛素化通过蛋白酶体途径降解。11、PTZ诱导癫痫的Nedd4-2~(+/-)小鼠与野生型小鼠海马组织IP-MS筛查Rer1的相互作用底物,Nedd4-2~(+/-)小鼠与野生型小鼠分别检测到127个和133个Rer1互作蛋白;两组的共同互作蛋白有72个,GO分析提示与“蛋白结合”、“膜”、“神经递质”和“突触”等有关;两组的差异互作蛋白中,Rer1表达上调的Nedd4-2~(+/-)小鼠独有的蛋白质有55个,GO分析提示与“突触”、“神经递质受体”、“跨膜转运子”有关。12.选择差异互作蛋白Gabra1作Co-IP验证,结果显示小鼠全脑组织中Gabra1和Rer1存在相互作用,且该互作于Nedd4-2~(+/-)小鼠强于野生型小鼠。13.小鼠全脑组织蛋白Endo-H消化切除ER加工的糖苷键,Western blot显示Gabra1的分子量变小,Nedd4-2~(+/-)小鼠未消化的高分子量Gabra1水平略低于野生型小鼠,Endo-H消化的低分子量Gabra1水平显著高于野生型小鼠,提示Nedd4-2~(+/-)小鼠脑组织Gabra1发生更多的ER滞留。结论:1.Nedd4-2~(+/-)小鼠单倍剂量不足降低了对ER应激和PTZ诱导癫痫的保护作用。2.NEDD4-2通过与RER1的~(36)STPY~(39)基序互作介导RER1泛素化和蛋白酶体途径降解。3.Nedd4-2~(+/-)小鼠海马组织IP-MS筛查到Rer1可能ER滞留的多种神经突触活性底物,验证其中Gabra1为Rer1的新底物,Nedd4-2~(+/-)小鼠全脑组织Rer1介导更多的Gabra1发生ER滞留。