艾滋病(Acquired Immune Deficiency Syndrome,AIDS)是由于感染人类免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirus,HIV)导致的综合征。在HIV-1生命周期中,逆转录酶(Reverse transcriptase,RT)负责将病毒单链RNA逆转录为双链DNA,因其在人体内不存在同源酶且作用机制明确,是目前抗艾滋病药物的重要作用靶点之一。作用于 RT 的非核苷类逆转录酶抑制剂(Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors,NNRTIs)以高效低毒的优势广泛应用于“高效抗逆转录病毒疗法”治疗AIDS,但长期使用NNRTIs会产生严重的耐药性及毒副作用。此外,当感染HIV后,部分病毒处于转录沉默或转录后沉默状态,不产生感染性病毒颗粒,形成潜伏感染,这些潜伏的病毒既不能被免疫系统识别也不能被抗病毒药物杀死,但是一旦停止抗逆转录病毒疗法(Antiretroviral therapy,ART)治疗后将会重新激活,出现严重的病毒反弹,这也是根治HIV感染的主要障碍。目前针对HIV潜伏沉默细胞储存库的清除策略主要有激活杀死策略和阻断锁定策略,均处于探索研究阶段。近期有文献报道激活杀死策略无法有效清除HIV潜伏库,因此本论文聚焦于阻断锁定策略进行研究。基于以上问题,发现新型NNRTIs,克服当前NNRTIs存在的耐药性和毒副作用以及应用新技术新策略清除HIV病毒潜伏库,是抗艾滋病药物研究领域的重大问题。因此,本论文从两个方面,即发现新型高效低毒具有良好抗耐药性的NNRTIs以及应用阻断锁定策略发现HIV潜伏沉默促进剂,以期提高NNRTIs出现抗耐药性并进一步探索HIV功能性治愈的新途径。基于靶标的新型二芳基嘧啶类NNRTIs的设计、合成与生物学评价针对目前上市的NNRTIs存在的严重耐药性及药代动力学性质差的科学问题,本章以本课题组前期发现的候选药物K-5a2为先导,基于K-5a2/RT复合晶体结构解析,利用靶向保守氨基酸、主链氢键以及多位点结合等高效抗耐药性药物设计策略以及封闭代谢位点等改善成药性质的修饰策略,对K-5a2的中心母环和右翼进行结构修饰,通过利用亲核取代、Buchwald-Hartwig交叉偶联反应和Wittig-Hornor等反应合成了三个系列共56个新型DAPY类NNRTIs,并利用ESI-MS和NMR对目标化合物进行结构确证。利用MTT法在MT-4细胞中对目标化合物进行体外抗病毒活性筛选,构效关系表明,在K-5a寻找更多2的噻吩环上引PLX3397体外入甲基,所得化合物IB-5b对HIV-1 WT和多数突变株均表现出纳摩尔的抗病毒活性(EC50(WT)=0.002 μM;EC50(L10vaginal infection1I)=0.016μM;EC50(K103N)=0.002μM;EC50(Y181C)=0.008μM;EC50(Y188L)=0.007μM;EC50(E138K)=0.007μM;EC50(F227L+V106A)=0.024μM;EC50(RES056)2.30μM)。初步的成药性评价表明 IB-5b 对五种常见的CYP酶亚型的抑制活性较低,其在大鼠体内清除速率(CL=26.7 mL/min/kg)较低以及口服生物利用度(F=34.9%)较为理想;在1000 mg/kg的剂量下,IB-5b对小鼠没有明显的急性毒性,可作为抗艾滋病候选药物进行进一步的开发。此外,封闭K-5a2右翼上的N-亚甲基易代谢位点得到活性最好的化合物是ⅡH-1c,其对HIV-1 WT和多数突变株均表现出较好的抗病毒活性,尤其是对双突变株RES056,ⅡH-1c(EC50=42 nM)表现出与K-5a2(EC50=30 nM)相当的活性;体外肝微粒体代谢实验结果表明ⅡH-1c(t1/2=15.7 min)在体外表现出显著优于K-5a2(t1/2=2.4min)的稳定性,验证了设计的可行性。新型HIV潜伏沉默促进剂的设计、合成与活性评价BRD4是溴结构域蛋白BET家族中研究最为深入的一种蛋白,其通过C端结构域与正性转录延伸因子(P-TEFb)结合调控HIV转录,是目前清除HIV潜伏沉默库研究的重要靶点之一。胡海涛课题组通过结构导向的药物设计发现了一种靶向BRD4的新型潜伏沉默促进剂ZL0580,其可以促进BRD4与P-TEFb的结合从而抑制HIV转录,使潜伏的HIV进入深度潜伏状态。本章基于阻断锁定策略,以ZL0580为先导化合物,运用计算机虚拟筛选、骨架跃迁、生物电子等排以及取代基多样性等方法与策略,通过还原反应、Sonogashira偶联反应、加成反应、酰胺缩合反应以及点击化学等方法,共设计合成了 49个靶向BRD4蛋白的新型HIV潜伏沉默促进剂,并利用ESI-MS和NMR对化合物进行结构确证。通过MTT法和荧光素酶实验在SupT1细胞中对目标化合物进行毒性和体外HIV转录和前病毒再激活抑制作用的生物学评价。毒性评价结果发现三芳基吡咯烷类衍生物中多数化合物表现出低于ZL0580的细胞毒性。荧光素酶实验结果显示,IVA-7h和IVA-7k对HIV转录表现出较强的阻断作用,且呈现浓度依赖性,其在25 μM下的残留表达量分别为17.12%和22.40%。利用TNF-α刺激后,IVA-7h和IVA-7k对HIV再激活也呈现出与阻断转录相一致的抑制作用,其在25 μM下的残留表达量分别为24.26%和21.35%。通过蛋白热稳定迁移实验和表面等离子共振技术发现IVA-7k(Kd=0.704 μM)和IVA-7h(Kd=0.128μM)与BRD4具有较强的结合力。Western Blot和蛋白免疫共沉淀实验证实IVA-7h通过促进BRD4蛋白与P-TEFb结合从而抑制转录。最后,利用流式细胞术实验进一步证实IVA-7h对HIV转录以及前病毒再激活具有阻断和锁定作用。综上,本论文基于K-5a2/RT的复合晶体结构,利用靶向保守氨基酸、主链氢键以及多位点结合等药物设计策略设计合成了三个系列化合物,通过细胞活性筛选和酶活测试获得了对HIV-1 WT和突变株均表现出突出抑制活性的NNRTIs ⅠB-5b、ⅡH-1c和ⅢA-10j,其中ⅠB-5b还表现出了良好的药代动力学性质,可作为NNNRIs候选药物进行进一步开发。同时,着眼于阻断锁定策略,靶向BRD4蛋白发现了对HIV转录和前病毒再激活具有较强的阻断和锁定作用的潜伏沉默促进剂IVA-7h和IVA-7k,为研发功能性治愈HIV感染提供了新的思路。