自噬(Autophagy)是指细胞在外界环境因素的影响下,细胞利用溶酶体降解自身受损、变性或衰老的大分子物质以及细胞器的自我消化过程。自噬能把这些物质转化可重新利用的营养成分,从而降低细胞受到的各种损伤。光动力治疗(Photodynamic therapy,PDT)治疗癌症的过程中,癌细胞由于受到活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的刺激,会导致自噬的发生,保护性自噬会促进癌细胞的存活并降低PDT的治疗效果。然而过度激活自噬能促进细胞发生凋亡,本研究使用光敏剂焦脱镁叶绿酸-a(Pyropheophorbide-a,Ppa)产生大量的ROS达到杀伤癌细胞的效果,同时通过联用自噬诱导剂淫羊藿素(Icaritin,Ica)过度激活自噬,使自噬对癌细胞的保护作用转变为促进凋亡的作用,最终达到提高PDT治疗效果的目的。然而,使用传统的载体对同时递送Ppa和Ica到达肿瘤部位协同治疗,将不可避免地带来一些毒副作用。自组装纳米药物依靠小分子药物间的相互作用组装形成纳米级颗粒,无需额外的载体即可将药物递送到肿瘤区域,具有较高的载药量以及拥有较高的生物安全性。本研究利用Ica与Ppa之间的分子间相互作用力,成功构建了具有良好稳定性、高载药量等特点的自组装纳米药物IP。其中,该纳米药物的合成方法简单,通过药物自身作为载体,能使Ica与Ppa的载药量(Loading Efficiency,LE)分别高达83.53%和16.45%,且没有引入额外的载体材料以造成潜在的生物安全性隐患。此外,自组装纳米药物IP能通过过度激活自噬放大ROS带来的氧化应激,进而增强PDT的光毒性,这种协同策略显著地提高了PDT的抗肿瘤效果。研究目的:本研究拟将自噬诱导剂Ica与光敏剂Ppa通过自组装的方法制备形成纳米药物,以实现诱发癌细胞发生过度自噬,协同增强光动力学的抗肿瘤效果。首先对Ica与Ppa是否能形成纳米药物进行试验,以及检验二者之间的组装机制。探究纳米药物的稳定性以及药物载药率,阐明了自组装纳米药物相对于游离药物具有高稳定性与高载药率。对纳米药物在细胞摄取以及产生活性氧的能力等方面进行考察,突出了纳米药物具有易被细胞摄入和高效产活性氧的优势。探究纳米药物在光动力治疗与化疗的协同治疗后对肿瘤细胞的杀伤效果。重点阐明肿瘤细胞光动力学治疗与化疗之间的协同关系,进而揭示肿瘤治疗的新思路和新方法。方法:1.纳米药物IP的制备与表征:首先使用溶剂-反溶剂沉淀法合成得到自组装纳米药物IP,通过紫外-可见分光光度计(Ultraviolet-visible Spectrophotometer,UVS)与高效液相色谱仪(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)分别检测IP中Ica与Ppa的载药量,使用透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope,TEM)观察纳米药物IP的微观形态,并使用马尔文粒径仪检测其稳定性。2.纳米药物IP自组装机制的探究:通过UVS,比较在不同溶液中纳米药物IP在660 nm处的最大吸收峰的变化。3.纳米药物IP被细胞摄取的能力:通过使用CLSM、流式细胞仪分别测定经过纳米药物IP处理后的小鼠乳腺癌细胞在的荧光强度,检验纳米药物IP被细胞摄取的能力。4.纳米药物IP产生ROS的能力:使用荧光分光光度计检测纳米药物IP在水溶液中ROS的生成,其中SOSG作为单线态氧的检测试剂。利用激光扫描共聚焦显微镜(Confocal Laser Scanning Microscope,CLSM)观察经过纳米药物IP处理后,分别使用CellROX~(TM)Green探针和DCFH-DE探针染色后小鼠乳腺癌细胞的荧光强度。5.纳米药物IP诱导自噬的能力:在CLSM下,使用Rhodamine 123研究经过纳米药物IP处理过的小鼠乳腺癌细胞的线粒体形态。通过蛋白质印迹法(Western Blot,WB)考察纳米药物IP诱导小鼠乳腺癌细胞发生自噬的性能。6.纳米药物IP的协同治疗的能力:采用MTT比色法、活/死细胞染色法和流式细胞术检测细胞凋亡来考察纳米药物IP对小鼠乳腺癌细胞的生长抑制作用,进而阐明纳米药Sub-clinical infection物IP的抗肿瘤效果。结果:1.动态光散射(Dynamic Light Scattering,DLS)法测得纳米药物IP的粒径大小为176.5±2.17 nm,多分散系数为0.171±0.015,且能在7天内保持稳定。从透射电子显微镜中观察,纳米药物IP在水中表现出均一的短棒状结构,且能够均匀分散。利用HPLC检测得出的结果经过计算后可以得出,纳米药物IP中Ppa和Ica的包封率分别为24.52%和61.11%,载药量分别为16.45%和83.53%。2.纳米药物IP的紫外-可见吸收光谱显示在660 nm处有纳米药物IP的特征吸收峰,且疏水性的十二烷基硫酸钠(Sodium Dodecyl Sulfate,SDS)会对纳米药物IP的吸收光谱产生相影响,表明纳米药物IP通过疏水作用力进行自组装。3.使用CLSM观察纳米药物IP的摄取情况显示,IP组的红色荧光无论在时间梯度或浓度梯度,都比游离药物Ppa更强。这表明纳米药物IP能比游离的Ppa更容易被小鼠乳腺癌细胞摄取。4.SOSG检测纳米药物IP单线态氧~1O_2的产生情况,相对于游离药物Ppa,纳米药物IP在光照后,荧光强度显著性增强。在细胞层面中,CellROX~(TM)Green探针或DCFH-DA作为ROS传感器来检测ROS的产生结果说明,纳米药物IP在光照后能够产生的大量的ROS,且相较于游离的Ppa产生ROS的能力更强。这表明光动力学治疗能够通过激活光敏剂Ppa产生大量ROS。5.罗丹明123染色结果表明,Ica可引发细胞的线粒体发生明显聚集,这表明Ica能够诱导小鼠乳腺癌细胞发生自噬,且WB分析实验的统计结果显示,经过纳米药物IP处理后,小鼠乳腺癌细胞的自噬相关蛋白5(Autophagy Related Protein 5,ATG5)显著上调,而微管相关蛋白1轻链3β(Microtubule-associated Protein 1 Light Chain 3 beta,LC3B)的变化也显示纳米药物IP能够诱导小鼠乳腺癌细胞发生自噬。6.MTT比色实验显示纳米药物IP对小鼠乳腺癌细胞存在浓度依赖性的光毒性。活寻找更多/死细胞染色实验GNE-140临床试验证明,经过光照后,经过游离药物Ppa和纳米药物IP处理的细胞红色荧光明显增强,且纳米药物IP表现更加明显。流式细胞术检测细胞凋亡实验证明,纳米药物IP处理后的细胞经过光照后造成的凋亡率远高于其它组别。研究结论:1.DLS与透射电子显微镜结果显示以Ppa和Ica为原料组成的无载体自组装纳米药物IP(简称为IP)能够形成稳定性良好,形态均一的短棒状纳米颗粒。HPLC结果显示纳米药物IP具有较好的载药量与包封率,且纳米药物IP是通过疏水作用力进行自组装。表明成功构建了自组装纳米药物IP,形成稳定性强、水溶性好、载药量高的纳米药物。2.小鼠乳腺癌细胞摄取实验表明,纳米药物IP增强了光敏剂的摄取。SOSG实验结果与DCFH-DA和CellROX~(TM)Green实验结果比较,表明纳米药物IP能够通过增强光敏剂的摄取量以提高ROS的产生。3.罗丹明123染色和WB分析实验结果表明,纳米药物IP能够诱导小鼠乳腺癌细胞发生自噬。纳米药物IP协同光动力治疗过度激活细胞自噬4.细胞毒性实验证明,经过光照后纳米药物IP具有在明显的抗小鼠乳腺癌细胞的效果,表现出纳米药物IP在光动力治疗中的巨大潜力。