第一部分:δ-阿片受体激活后对帕金森病模型发挥神经保护作用的研究目的:帕金森病是老年人常见的一种以运动功能障碍为主要特征的神经退行性疾病,发病人群主要集中在60岁以上的老年人。目前帕金森病经典的治疗方案是多巴胺替代治疗和抗胆碱能药物治疗,虽然可以缓解症状但仍有许多局限性。因此我们迫切的需要开发更多的更有效的治疗PD的药物。研究表明δ-阿片受体可能是潜在的治疗靶点,但仍需更多实验支持并探究机制,因此我们在这一部分探究了 δ-阿片受体激活后对帕金森病模型发挥的神经保护作用。方法:研究基于PC12细胞及C57BL/6小鼠,建立PD细胞及动物模型,设立对照组、PD 组、PD+DADLE 组、PD+DADLE+Naltrindole 组、PD+Naltrindole组。利用CCK-8法和LDH漏出率的检测,同时倒置显微镜下观察细胞形态,评估δ-阿片受体在MPP+诱导的细胞的神经保护作用。通过行为学实验评估运动症状、免疫荧光法测定黑质及纹状体区酪氨酸羟化酶,评估δ-阿片受体在MPTP诱导的小鼠的神经保护作用。结果:1、PC12细胞模型:用倒置显微镜观察结果显示,在MPP+、MPP++DADLE+Naltrindole组、MPP++Naltrindole组中观察到漂浮的细胞,对照组及MPP++DADLE组形态正常。CCK-8检测结果显示,与对照组(98.50%±1.17%)相比 MPP+组(52.50%±2.58%)细胞活力下降(P<0.01),与 MPP+组比较 MPP++DADLE 组(82.50%±3.08%)细胞活力增加(P<0.01)。LDH检测显示,与对照组(4.95%±0.24%)相比MPP+组(28.72%±1.49%)LDH泄漏率增加(P<0.01),与 MPP+组比较 MPP++DADLE 组(10.00%±3.08%)LDH泄漏率下降(P<0.01)。2、C57BL/6小鼠模型:行为学实验结果显示,MPTP组小鼠的运动距离(t=86.09,P<0.01)及平均速度(t=28.34,P<0.01)显著低于对照组,而MPTP+DADLE处理小鼠的运动距离(t=6.83,P<0.01)和平均速度显著(t=21.44,P<0.01)高于MPTP组小鼠。免疫荧光结果显示,与对照组比较,MPTP组小鼠黑质区(t=28.34,P<0.01)和纹状体区(t-30.50,P<0.01)TH阳性的细胞数显著减少。而与MPTP组小鼠比较,MPTP+DADLE处理小鼠的黑质区(t=33.80,P<0.01)和纹状体区(t=13.83,P<0.01)TH阳性的细胞数显著增加。结论:1、δ-阿片受体可改善MPP+诱导的PC12细胞的细胞形态、减轻细胞毒性、提高细胞活力;2、δ-阿片受体可改善MPTP诱导的C57BL/6小鼠运动障碍、减轻黑质及纹状体区多巴胺能神经元的损伤。第二部分:6-阿片受体激活后通过上调Nrf2抑制MPTP诱导的C57BL/6小鼠多巴胺能神经元中铁死亡的研究目的:虽然目前已知帕金森病的主要病理改变是黑质和纹状体中多巴胺能神经元的丢失,但这种改变的确切机制尚不清楚。有研究表明多巴胺能神经元的丢失可能与铁死亡密切相关。因此我们在这一部分探究激活δ-阿片受体在MPTP诱导的C57BL/6小鼠中的神经保护作用与铁死亡的关联及其潜在机制。方法:建立MPTP诱导的C57BL/6小鼠模型,设立对照组、MPTP组、MPTP+铁死亡抑制剂(Ferrostatin-1)组、MPTP+DADLE 组、MPTP+DADLE+Naltrindole组、MPTP+Naltrindole组。利用行为学实验评估运动症状,免疫荧光法测定compound probiotics黑质及纹状体区酪氨酸羟化酶。利用ELISA测定小鼠脑组织中丙二醛(MDA)和4-羟基壬烯醛(4-HNE)水平,评估脂质过氧化情况。利用透射电镜观察线粒体形态变化。采用WB,评估Nrf2、GPX4、SLC7a11等抗铁死亡蛋白的表达水平。结果:1、行为学实验结果提示,MPTP+F errostatin-1处理小鼠的运动距离(t=32.52,P<0.01)和平均速度(t=33.80,P<0.01)显著高于MPTP处理小鼠,且MPTP+F errostatin-1 组与 MPTP+DADLE 组比较运动距离(t=1.19,P=0.26)无统计学意义。免疫荧光结果提示,MPTP+F errostatin-1处理小鼠的黑质区(t=21.44,P<0.01)及纹状体区(t=14.45,P<0.01)的酪氨酸羟化酶阳性细胞数显著高于MPTP处理小鼠。与MPTP+DADLE组比较,MPTP+Ferrostatin-1组的黑质区(t=1.55,P=0.16)及纹状体区(t=0.12,P=0.90)酪氨酸羟化酶阳性细胞数无统计学差异。2、通过ELISA测定,MPTP组小鼠的中脑黑质组织内MDA(t=25.48,P<0.01)及4-HNE(t=7.67,P<0.01)水平显著高于对照组。与MPTP组小鼠比较,MPTP+DADLE组小鼠的中脑黑质组织内MDA(t=24.19,P<0.01)及4-HNE(t=2.34,P<0.05)水平显著下降,MPTP+DADLE+Naltrindole 组与MPTP+DADLE 组比较 MDA(t=22.70,P<0.01)及4-HNE(t=2.87,P<0.05)水平显著升高。MPTP+F errostatin-1组小鼠的中脑黑质组织内MDA(t=31.15,P<0.01)及4-HNE(t=5.87,P<0.01)水平显著低于MPTP组小鼠。与MPTP+DADLE 组比较,MPTP+F errostatin-1 组的中脑黑质组织内 MDA(t=2.01,P=0.07)及4-HNE(t=2.51,P=0.06)水平无统计学差异。3、通过TEM检测了小鼠中脑黑质组织中神经元细胞内超微结构的改变,对照组正常形态的线粒体,线粒体脊和线粒体外膜完整。MPTP组的线粒体脊消失和线粒体外膜被破坏。MPTP+F errostatin-1处理的小鼠和MPTP+DADLE处理小鼠的中脑黑质神经元细胞内线粒体脊未见消失和线粒体外膜未被破坏,神经元细胞内线粒体形态完整。4、WB结果显示,与对照组比较,MPTP组的GPX4(t=178.70,P<0.01)、SLC7a11(t=40.36,P<0.01)、Nrf2 6.68,P<0.01)的表达水平显著降低。与MPTP组的小鼠比较,MPTP+DADLE组小鼠的中脑黑质组织中的GPX4(t=91.31,P<0.01)、SLC7a11(t=34.59,P<0.01)、Nrf2(t=16.13,P<0.01)表达水平显著升高,MPTP+DADLE+Naltrindole 组较 MPTP+DADLE 组的 GPX4(t=68.15,P<0.01)、SLC7a11(t=30.55,P<0.01)、Nrf2(t=8.15,P<0.01)表达水平又显著下降。MPTP+F errostatin-1组小鼠的中脑黑质组织中的GPX4(t=118.0,P<0.01)、SLC7a11(t=50.78,P<0.01)、Nrf2(t=19.84,P<0.01)表达水平显著高于MPTP组小鼠。同时MPTP+F errostatin-1组小鼠的中脑黑质组织中的 GPX4(t=2.36,P=0.07)、SLC7a11(t=0.64,P=0.55)、Nrf2(t=0.46,P=0.91)表达水平与MPTP+DADLE组无统计学意义。结论:1、δ-阿片受体与铁死亡抑制剂对MPTP诱导C57BL/6小鼠均具有神经保护作用;2、δ-阿片受体与铁死亡抑制剂对MPTP诱导C57BL/6小鼠均可抑制脂质过氧化水平及线粒体破坏且效果一致;3、δ-阿片受体可能通过上调Nrf2、SLC7a11、GPX4表达抑制了MPTP诱导C57BL/6小鼠多巴胺能神经元中的铁死亡。第三部分:δ-阿片受体激活后通过Nrf2-GPX4/SLC7a11通路抑制MPP+诱导的PC12细胞铁死亡的研究目的:铁死亡参与了帕金森病的发病机制。本研究在动物模型中发现δ-阿片受体(DOR)激活后通过Nrf2抑制铁死亡。于是本研究在细胞模型中进一步进行验证,探究激活δ-阿片受体是否通过Nrf2-GPX4/SLC7a11通路抑制铁死亡发挥抗帕金森病作用。方法:本研究构建MPP+诱导的PC12细胞模型,设立对照组、MPP+组、MPP++Ferrostatin-1 组、MPP++DADLE 组、MPP++DADLE+Naltrindole 组、MPP++Naltrindole组。采用CCK-8法和LDH漏出率检测,评估细胞毒性及活力。使用Western blot评估抗铁死亡蛋白(GPX4和SLC7a11)和Nrf2蛋白表达水平。使用ELISA测量丙二醛(MDA)和4-羟基壬烯醛(4-HNE)水平,评估脂质过氧化水平。使用JC-1染色,在MPP+诱导的细胞中确认细节测定线粒体膜电位。利用SiRNA技术在PC12细胞模型中敲低Nrf2,激活DOR后评估细胞毒性及活力,测定GPX4、SLC7a11、Nrf2蛋白表达水平,评估脂质过氧化水平,测定线粒体膜电位。结果:1、细胞毒性及活力结果显示,与MPP+组相比,MPP++DADLE组的PC12细胞生存率显著增加(t=17.60,P<0.01)、LDH漏出率显著降低(t=18.62,P<0.01)。与MPP+组相比,MPP++F errostatin-1组的PC12细胞存活率显著增加(32.80%±1.79%,P<0.05)、LDH 泄漏率显著降低(22.70%±0.66%,P<0.05)。MPP++DADLE 组和 MPP++F errostatin-1 组的细胞存活率(t=10.56,P=0.26)无统计学意义。与MPP++DADLE组比较,MPP++DADLE+SiRNA(-)组的细胞生存率无统计学意义(t=0.19,P=0.85),但MPP++DADLE+SiRNA(Nr2)组的细胞生存率显著降低(t=15.80,P<0.01)。与 MPP++DADLE 组比较,MPP++DADLE+SiRNA(-)组的LDH漏出率无统计学意义(t=0.44 P=0.66)。但MPP++DADLE+SiRNA(Nrf2)组的LDH漏出率显著增加(t=14.30,P<0.01)2、WB结果显示,与对照组比较,MPP+组的GPX4(t=9.10,P<0.01)、SLC7a11(t=8.64,P<0.01)、Nrf2(t=3.92,P<0.01)的表达水平显著降低。与 MPP+组比较,MPP++DADLE组中的 GPX4(t=5.35,P<0.01)、SLC7a11(t=6.80,P<0.01)、Nrf2(t=3.91,P<0.01)表达水平显著升高,但 MPP++DADLE+Naltrindole 组较MPP++DADLE 组的 GPX4(t=5.14,P<0.01)、SLC7a11(t=5.50,P<0.01)、Nrf2(t=4.00,P<0.01)表达水平又显著下寻找更多降。MPP++Ferrostatin-1 组中的 GPX4(t=4.87,P<0.01)、SLC7a11(t=4.72,P<0.01)、Nrf2(t=3.38,P<0.01)表达水平显著高于MPP+组。同时MPP++F errostatin-1组与MPP++DADLE组的GPX4(t=2.73,P=0.052)、SLC7a11(t=058,P=0.59)、Nrf2(t=0.78,P=0.44)表达水平无统计学意义。与 MPP++DADLE 组比较,MPP++DADLE+SiRNA(-)组Nrf2(t=0.17,P=0.86)、GPX4(t=0.77,P=0.48)、SLC7a11(t=1.71,P=0.16)的表达水平无统计学意义。但 MPP++DADLE+SiRNA(Nrf2)组 Nrf2(t=5.49,P<0.01)、GPX4(t=4.13,P<0.01)、SLC7a11(t=7.27,P<0.01)的表达水平显著低于 MPP++DADLE 组。3、ELISA结果显示,在MPP+诱导的PC12细胞中MDA(t=19.50,P<0.01)及4-HNE(t=5.27,P<0.01)水平显著高于对照组。与MPP+组比较,MPP++DADLE 组(t=16.92,P<0.01)和 MPP++F errostatin-1 组(t=15.53,P<0.01)的MDA水平显著下降。与MPP+组比较,MPP++DADLE组(t=3.35,P<0.01)和 MPP++F errostatin-1 组(t=4.12,P<0.01)的4-HNE 水平显著降低。MPP++DADLE 组和 MPP++F errostatin-1 组间的 MDA(t=0.36,P=0.72)及4-HNE(t=0.26,P=0.79)水平无统计学差异。与 MPP++DADLE 组比较,MPP++DADLE+SiRNA(-)组的 MDA(t=0.11,P=0.91)及4-HNE(t=0.28,P=0.78)水平无统计学意义。但MPP++DADLE+SiRNA(Nrf2)组的 MDA(t=17.70,P<0.01)及 4-HNE(t=1.94,P<0.05)水平显著增加。4、线粒体膜电位结果显示,与对照组比较,MPP+组的膜电位水平显著下降(t=86.09,P<0.01)。与MPP+组比较,MPP++DADLE组的膜电位水平显著增加(t=35.52,P<0.01)。但 MPP++DADLE+Naltrindole 组较 MPP++DADLE 组显著降低(t=33.51,P<0.01)。MPP++F errostatin-1组的膜电位水平显著高于MPP+组(t=24.83,P<0.01)。MPP++Ferrostatin-1 组与 MPP++DADLE 组的膜电位水平无统计学意义(t=1.07,P=0.31)。与MPP++DADLE组比较,MPP++DADLE+SiRNA(-)组的线粒体膜电位水平无统计学意义(t=0.10,P=0.92),但 MPP++DADLE+SiRNA(Nrf2)组的线粒体膜电位水平显著增加(t=33.21,P<0.01)。结论:1、δ-阿片受体减轻MPP+诱导的PC12细胞的细胞毒性、提高细胞活力、同时抑制脂质过氧化并改善线粒体膜电位,Nrf2敲低后δ-阿片受体的上述作用被逆转;2、δ-阿片受体与铁死亡抑制剂通过上调Nrf2、SLC7a11、GPX4表达抑制了 MPP+诱导PC12细胞中的铁死亡,Nrf2敲低后δ-阿片受体的抗铁死亡作用被逆转;3、δ-阿片受体可能通过Nrf2-GPX4/SLC7a11通路抑制MPP+诱导PC12细胞中的铁死亡,发挥抗帕金森病作用。