研究目的:巴特综合征(Bartter syndrome,BS)是一种罕见的遗传性肾小管疾病,由SLC12A1、KCNJ1、CLCNKA、CLCNKB、BSND或MAGED2基因的变异引起。越来越多的研究表明,很多外显子突变可以通过干扰各种剪接调节信号来影响前m RNA正常剪接并诱导外显子剪接跳跃,这可能是很多传统认为的错义、无义和同义突变的潜在真实致病机制。因此,本研究旨在全面分析与BS相关的所有外显子突变对前m RNA剪接的影响,进一步深入探索BS致病突变导致的不同的异常剪接形式。研究方法:搜集人类基因突变数据库(HGMD)和文献中报道的所有错义、无义和同义变体。运用生物信息学程序BDGP、HSF3.1和Mx Ent Scan,分析筛选可能影响经典剪接位点(5’供体剪接位点和3’受体剪接位点)和剪接调控序列[外显子剪接增强子(ESEs)和外显子剪接沉默(ESSs)]的突变体。最终我们确定了可能促进外显子跳跃的候选突变并通过迷你基因实验验证所有候选突变对剪接的影响。研究结果:利用生物信息学软件对170个突变进行了分析,最终初步确定了14个候选变异用于实验。RT-PCR实验结果表明,14个候选变异中有12个突变体导致了异常的剪接改变,其中包括7个SLC12A1基因突变(c.728G>A、c.735C>G、c.904C>T、c.905G>A、c.1304C>T、c.1493C>T、c.2221A>T)和5个CLCNKB基因突变(c.226C>T、c.228A>C、c.229G>A、c.229G>C、c.1979C>A)。这些变体分别分布在7个不同的外显子上并引起了不同程度的外显子跳跃。1.SLC12A1基因序列变异的剪接研究结果:1.1位于外显子5的突变c.728G>A、c.735C>G,外显子6的突变c.904C>T、c.905G>A,以及位于外显子11的突变c.1493C>T引起了外显子的部分跳跃。BDGP提示,C.728G>A可使3’受体剪接位点的评分由0.99降至0.98。HSF3.1预测分析表明c.735C>G、c.904C>T、c.905G>A和c.1493C>T都导致了潜在的重叠ESEs的破坏和新的ESSs的产生。实验结果表明,在突变型和对照迷你基因中检测到的剪接产物是不同的。对照迷你基因(p SPL3 Ex5、p SPL3 Ex6、p SPL3 Ex11)产生一个独特的条带,而突变迷你基因(c.728G>A、c.735C>G、c.904C>T、c.905G>A和c.1493C>T)分别生成两个不同的条带。较大的扩增片段是包含对应外显子的转录物,而较小的扩增片段仅包含3’和5’p SPL3外显子。1.2错义突变c.1304C>T导致了外显子10的完全跳跃。突变体c.1304C>T位于外显子10的第4位核苷酸。结合BDGP的分析结果,这个变异导致3’受PS-341价格体剪接位点的得分从0.87降低到了0.84。RT-PCR实验结果显示,突变迷你基因的扩增产物为263bp,而野生型迷你基因扩增产物为415bp。测序分析证实该突变引发了外显子10的跳跃。较大的片段对应于正确剪接的外显子,而较小的条带对应于没有外显子10的转录本。1.3无义突变c.2221A>T导致了外显子17的完全跳跃。位于SLC12A1基因外显子17的无义变体c.2221A>T将编码赖氨酸的AAG密码子变为终止密码子TAG。剪接预测分析软件HSF3.1的分析结果表明,这个变体不仅破坏了四个ESE,而且还产生了两个ESS。RT-PCR分析结果表明,WT和MUT株产生了不同大小的产物。WT迷你基因产生了一个404bp的PLX3397抑制剂条带,而MUT迷你基因产生了一个263bp的产物。较大的扩增片段是含有外显子17的转录物,而较小的是不含外显子17的转录物。2.CLCNKB基因序列变异的剪接研究结果:2.1与WT构建体相比,突变体c.226C>T,c.228A>C,c.229G>A,c.229G>C促进了外显子2跳跃。剪接预测分析工具BDGP和Mx Ent Scan的分析结果提示这四个突变均可能会导致经典的5’供体剪接位点的得分降低。RT-PCR分析表明,所有WT和MUT迷你基因都产生了两个不同大小的条带,分别为263bp和392bp。但是,与对照质粒相比,这些突变体的外显子2跳跃的转录物的数量显着增加。2.2与野生型构建体相比,无义突变c.1979C>A增加了外显子18排除的转录物的数量。HSF3.1预测该变体不仅消除了五个ESE,而且产生了三个新的ESS。结果,在HEK293T和Hela细胞中的WT迷你基因的c DNA产物中均发现了263bp(对应于缺陷转录物)和350bp(对应于成熟转录物)这两种产物。然而,在突变型迷你基因中仅仅发现了263bp的独特产物,这表明这个突变体显著增强了前m RNA剪接,促进了CSF AD biomarkers外显子18的剪接跳跃。研究结论:这是一项关于BS致病基因外显子变体引起前m RNA变化的综合研究。我们的结果强调了在m RNA水平评估外显子变异的后果的必要性。