花椰菜(学名:Brassica oleracea var.botrytis Linnaeus)是十字花科、芸薹属植物野甘蓝的变种。其包含维生素A、维生素C、蛋白质、脂肪、钙及β-胡萝卜素等,具有预防癌症及冠状动脉各种疾病的功效。花椰菜不耐长期霜冻,生育适宜温度为17～20℃,25℃时种子发芽最快,幼苗生长适宜温度20～25℃,而花椰菜在我国种质资源匮乏,尤其缺乏抗寒种质资源。为此本研究以花椰菜松散型愈伤组织为试验材料,经过EMS体细胞诱变、羟脯氨酸筛选,获得突变细胞系,再通过体胚发生,获得花椰菜突变体植株,目的是培育耐寒花椰菜品种;为了进一步验证花椰菜突变体所具备耐寒性的特点,在突变体植株经过伸长和生根培养后将其移栽,移栽成活1月后对其叶片解剖结构(气孔密度等)、光合特性进行研究,同时对其叶片低温处理12h后进行生理指标和转录组的测定,找到变异株在表现型以及遗传表达上的抗寒性的变化特征,进而验证利用花椰菜体细胞离体诱变技术筛选抗寒突变体植株的可行性,以期为花椰菜抗寒品种培育奠定一定的基础。主要研究结果如下:(1)对花椰菜突变体株系叶片进行徒手解剖,制成切片观察,发现花椰菜突变体株系叶片厚度存在显著差异,7个突变体株系中有6个的叶片厚度大于CK,7个花椰菜突变株系和CK的叶片厚度排序为:Y232>Y308>Y266>Y7>Y140>Y8>CK>Y149;就表皮细胞厚度来说,突变体植株变化不显著;而突变体叶片下表皮的气孔特性变化极显著,7个突变体株系的气孔密度都小于CK,且差异达到极显著。气孔密度大小排序为:CK>Y140>Y232>Y149>Y8>Y7>Y266>Y308。(2)通过光合仪测定花椰菜突变株系的光合作用,结果显示,花椰菜突变体的光合特性存在显著差异。从净光合速率方面分析,花椰菜突变体株系的净光合速率都高于CK,整体上花椰菜突变株系的净光合速率相对CK增长了1.080μmol/m~2/s-16.832μmol/m~2/s;从胞间CO_2浓度来看,7个突变体株系除了Y149的胞间CO_2浓度显著高于CK外,其他株系都低于CK;从气孔导度分析,株系Y149的气孔导度显著低于CK,为409.227mmol/m~2/s,是CK的0.883倍,其他6个株系的气孔导度显著高于CK;从蒸腾速率来看,花椰菜突变体与正常花椰菜植株间变化较小,其中Y8、Y266和Y308的蒸腾速率显著高于CK,分别为4.588 mmol/m~2/s、1.976 mmol/m~2/s和2.232 mmol/m~2/s,分别是CK的3.872、1.668和1.884倍,其余株系的蒸腾速率和CK差异不显著。(3)对低温处理后7个花椰菜突变体株系的叶片进行生理指标测定,分析结果发现70%-90%的耐羟脯氨酸花椰菜突变株系的游离Pro含量、SOD活性、可溶性糖含量、POD活性、可溶性蛋白含量和CAT活性都呈上升趋势,而丙二醛含量呈下降趋势。本文在以上基础下,对所研究的解剖指标、生理指标和气孔密度共十一个指标做了隶属函数分析,综合评价了耐羟脯氨酸花椰菜突变体和没有诱变的花椰菜间的抗寒性强弱,结果显示综合评价值大小为Y140(0.699)>Y266(0.682)>Y308(0.617)>Y232(0.587)>Y7(0.563)>Y8(0.482)>CK(0.328)>Y149(0),因此,和CK相比耐羟脯氨酸花椰菜突变体抗寒性更强。(4)通过高通量测序技术,对低温处理后变异植株和CK的转录组学进行研究分析,结果表明低温胁迫后,耐羟脯氨酸花椰菜突变体(Y308)和没有诱变的花椰菜(CK)间共鉴定出9580个差异基因,其中上调表达的差异基因有5273个,下调表达的差异基因有4307个。鉴定到的9580个差异基因共有4211个基因成功富集到GO Term上,分别被注释到分子功能(molecular function)、生物过程(biological process)和细胞组分(cellular component)3个GO本体的10、11和2条GO类别上,差异基因注释功能最多的是生物过程,然后是分子功能和细胞组分。差异表达基因主要参与和生物过程相关的生物调节(biological regulation)、细胞过程(cellular process)、对刺激的反应(response to stimulus)、代谢过程(metabolic process)和定位(localization)等,分子功能条目的差异表达基因主要影响结合(binding)和催化活性(catalytic activity),细胞组分条目相关的差异表达基因主要参与了含蛋白质复合物(protein-containing complex)和细胞解剖学实体(cellular anatomical entity)。而鉴定到的9580个差异基因共有8341个基因成功富集到5个通路分支共19条KEGG通路上,其中差异基因表达量富集最多的是代谢通路分支,包含11条KEGG通路selleck共5574个基因,有全局概述图通路和碳水化合物通路等通路。其他KEGG通路为:运输和分解代谢通路、薄膜运输、信号传导通路、折叠分拣和降解、复制和修复、转录、翻译和环境适应通路。KEGG Pathway富集显著富集中的前6个KEGG Pathway都属于代谢通路,分别是光合生物的固碳作用(Carbon fixation in photosynthetic organisms)、光合作用-天线蛋白(Photosynthesis-antenna proteins)、卟啉代谢(Porphyrin metabolism)、MAPK信号通路-植物(MAPK signaling pathway-plant)、碳代谢(Carbon metabolism)和氨基酸的生物合成(Biosynthesis of amino acids)。Naporafenib供应商对MAPK信号通路进一步分析,显著富集的KEGG Pathway为:MAPK信号通路-植物、植物病原体相互作用、植物激素信号转导ImmunoCAP inhibition。以上综合说明,差异表达基因主要在光合作用、碳水化合物代谢途径富集。MAPK通路是真核生物中广泛存在的信号转导途径,其基因表达量显著富集,说明突变体Y308在调节蛋白活性和信号转导方面较CK具有更强的作用,其中植物激素信号转导途径差异基因显著富集,植物内源激素能快速感知外界环境变化,对逆境做出调节,增强植物抗逆性,因此,以上途径提升了耐羟脯氨酸花椰菜突变体的耐冷能力,有效地保护了植株在逆境下的生长发育,提高存活率。