越来越多被广泛应用于消费品中的有机化合物被列为新污染物,引起了环境领域的广泛关注。三氯卡班Imidazole ketone erastin(TCC)是一种高效、广谱的抗菌试剂,广泛应用于沐浴用品、洗护用品、医用消毒剂等生活用品和医药用品的原料。TCC的抗生物降解性、高持久性和在环境的普遍性导致其具有潜在的生态风险。在新型冠状病毒肺炎疫情的影响下,大量药物和消毒剂的使用和积累导致TCC给生态、环境系统和人类健康带来更大的风险。已有研究表明,TCC易于从水体迁移到土壤环境中,可通过食物链生物累积。同时TCC在土壤环境中半衰期较长,并可诱导土壤动物(如蚯蚓)产生各类毒性效应。然而,氧化应激作为研究污染物毒性效应的重要指标,TCC的氧化应激效应目前并未得到广泛关注。现关于TCC的毒性效应仅停留在在个体水平上的剂量依赖性研究,以及少量氧化应激损伤的报道,而TCC在细胞和分子水平上诱导蚯蚓体腔细胞内氧化应激效应Alpelisib与抗氧化相关酶活性功能抑制的机制尚未阐明。为了更深入地了解TCC的氧化应激效应,并丰富研究层次,更好地分析TCC的综合毒性机制。基于上述研究进展,本研究在细胞和分子层面上选取了蚯蚓体腔细胞、两种典型抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)以及间接抗氧化酶溶菌酶(LZM)作为研究对象,揭示了 TCC的氧化应激效应机制,研究内容主要包括以下五个部分:第1章论述了环境中TCC的来源以及毒理学研究背景,介绍了 TCC的氧化应激毒性研究报道,并针对目前TCC目前广泛应用领域进行了总结,提出其对生态系统和人类健康的潜在危害仍值得关注。根据目前TCC毒性效应的研究进展,提出了研究领域亟待解决的关键科学问题,介绍了本研究的主要内容和研究价值。第2章在细胞水平构建了体外实验模型,以蚯蚓体腔细胞作为研究对象,检测不同剂量TCC暴露后蚯蚓体腔细胞内多项氧化损伤指标。TCC处理组体腔细胞活力下降至初始水平的77.3%,细胞内ROS、GSH、MDA水平均有不同程度的提高,证实了 TCC诱导蚯蚓体腔细胞产生氧化损伤。通过抗氧化实验,证实TCC能够显著抑制细胞内SOD(80.8%)和CAT(81.5%)活性。然而,我们发现抗氧化剂褪黑素能够削弱TCC对SOD和CAT活性的抑制作用,这一现象表明,TCC通过调节氧化应激效应影响SOD/CAT活性是一个潜在的机制。第3章在细胞实验研究的基础上,构建了 TCC与SOD和CAT直接结合的分子模型。在分子水平上,与TCC结合后,体外SOD活性受到抑制,CAT活性增强。结果证实,TCC影响SOD和CAT活性功能的另一个关键机制是TCC的直接结合作用。为了深入探讨TCC与SOD和CAT相互作用对其结构和功能的影响机制,进行了多光谱学、等温量热滴定法(ITC)和分子模拟技术综合研究。TCC的直接结合作用能够导致SOD/CAT蛋白骨架松动和多肽链扩展,破坏其二级结构。同时TCC与SOD和CAT的相互作用能够改变其聚集行为并形成了粒径更大的聚合体,以及破坏芳香族氨基酸的微环境。ITC实验表明,TCC通过相对温和的静电作用与SOD结合,而TCC通过更强亲和力的范德华力和氢键与CAT结合。TCC可以占据SOD的天然底物结合位点,导致SOD活性受到抑制。His 74、Asn 147和Tyr 357三种氨基酸残基均存在于CAT活性中心周围的结合口袋中,表明CAT活性的增强与其在血红素基团中结构的改变密切相关。研究结果全面揭示了 SOD/CAT在TCC诱导的氧化应激调控中的效应机制,并阐明了主要抗氧化酶SOD/CAT与TCC之间的相互作用机制。第4章在蛋白质分子水平上以溶菌酶(LZM)为研究对象,利用多光谱学技术探究了 TCC对LZM结构和构象的影响。TCC对活性中心附近的LZM残基有影响,使其氨基酸残基在较弱的极性微环境中重新定位。同时,TCAir Media MethodC与LZM的相互作用诱导产生了少量LZM的α-Helix结构,并改变了局部酰胺键(C=O)周围微环境,表明暴露于TCC后LZM的二级结构被破坏。α-Helix含量的增加促进了 LZM与TCC结合,LZM形成粒径较大的聚合体,表明蛋白骨架和多肽链被拉伸。此外,TCC可以通过分子间的相互作用,主要包括范德华力和氢键,以相对高的亲和力自发地与LZM结合,这是一种放热反应。进一步的分子对接结果表明,TCC结合位点位于LZM活性中心附近,与 Ala 107、Arg 112、Asn 59、Gln 57、Ile 98、Trp 108、Val109 和 Asp 52等多种残基相互作用。TCC与LZM和底物的结合位点发生相互作用,抑制了核心残基(Asp 52)对LZM活性的影响,从而表现出对天然底物的拮抗作用,导致LZM活性下降。这些结构变化会影响活性位点周围的构象和微环境,从而导致分子活性的抑制。本研究揭示了 TCC与LZM在结构和功能上相互作用的响应机制,并建立了 LZM与TCC结合的分子模型。第5章总结了本论文的主要实验内容,总结了创新点,提出了论文的不足之处并对下一步研究方向进行展望。在细胞层面,本研究探索了 TCC诱导蚯蚓体腔细胞产生的氧化应激相关毒性机制,通过抗氧化实验证实了 TCC能够诱导氧化损伤抑制抗氧化酶活性。通过模拟TCC与SOD和CAT的直接结合模型探究了 TCC影响SOD和CAT酶活性的分子机制,并对其结构和功能影响进行深入探讨。最后通过研究TCC与LZM的相互作用机制,从分子水平探究了 TCC对于间接抗氧化酶LZM活性和构象的影响,从而建立TCC与SOD、CAT和LZM三种抗氧化酶相互作用的结合模型。本论文在细胞和分子两个层面综合评价了 TCC的氧化应激毒性,为TCC毒性效应的研究提供了科学的参考依据