中药质量是中医药临床疗效的根本保证,中药质量控制也一直是中药现代化、国际化的关键问题之一。现行的中药质控标准虽然已经逐渐由无指标、单一指标成分向多指标成分过渡,但是指标成分与临床疗效关联不强、难以真正反映内在质量一直都是掣肘中药质量控制的关键瓶颈问题。在此背景下,生物活性评价指标和方法因具有关联药效的优势和特色而被引入,生物质控已经逐渐成为中药质量标准化的重要方向。但目前的生物质控研究仍存在部分中药采用的生物活性指标与临床应用脱节、单一生物活性指标难以代表具多功用特点中药整体质量的问题。柴胡是临床常用中药,始载于《神农本草经》,位列上品,功效为解表退热、疏肝解郁、升举阳气。《中国药典》2020版中收录了伞形科柴胡Bupleurum chinense DC.(北柴胡)和狭叶柴胡B.scorzonerifolium Willd.(南柴胡或红柴胡)两个品种,对北柴胡作了化学质控规定(柴胡皂苷a和d的总含量≥0.30%),对南柴胡仅作了性状上的描述而没有定性、定量鉴别标准。本研究聚焦于MLN4924体内实验剂量柴胡治疗外感发热的临床应用,从抗巨噬细胞活化、抗肥大细胞活化、抗氧化应激及解热这四类与此疗效相关的体外模型中寻找评价柴胡质量的可靠灵敏指标,以综合评估其解表退热作用的优劣与强弱。通过对12项生物指标的遴选,最终LPS诱导RAW264.7巨噬细胞生成NO、总抗氧化能力、LPS刺激小鼠全血细胞生成TNF-α以及体外凝集素/替代途径补体活化四项指标入围,以进行柴胡解表退热质量的生物评价。考虑到柴胡之解表功效以退热为主要特征,本论文赋予了与发热直接相关的全血细胞TNF-α生成(0.5)及补体活化(0.2)这两项指标共占比0.7的权重;而LPS诱导RAW264.7巨噬细胞生成NO与总抗氧化能力这两项指标的权重占比分别为0.2和0.1,初步建立了关联解表退热功效的柴胡质量生物评价方法。采用此评价模式,我们对6个不同种质柴胡样品(1#～6#)进行了评估,综合得分从高到低依次为6#>3#>1#>5#>4#>2#。由此,我们选择得分排名第一的6#(陕西北柴胡)作为柴胡退热机制的研究对象。早在《神农本草经》中即称柴胡“(主)寒热邪气”,如果能阐明柴胡在感染性发热中的主要作用机制,对完善其解表退热的生物评价及明确其物质基础均有决定性意义。本研究采用临床煎药方式制备了 6#柴胡的水提醇沉(滤液部分)物(XBCE),对其解热作用特点及机制展开了研究。结果显示,在LPS(i.v)诱导的发热大鼠模型上,XBCE(i.g.)展现出了明确而温和的退热效果。我们进一步围绕发热的外周机制展开了研究,结果表明:XBCE对外周三种内生致热原中的TNF-α有确切的压制作用,具体表现为它不仅能显著抑制LPS刺激的大鼠全血细胞和单核细胞THP-1分泌致热因子TNF-α(体外),还能明显降低内毒素血症大、小鼠血清TNF-α的水平(体内);同时XBCE还可有效抑制LPS诱导的补体活化(体外与体内),此作用也助益于其对TNF-α的压制。在明确了柴胡外周退热机制(抑制外周TNF-α)的基础上,本论文对富含皂苷的北柴胡提取物(SRBC)进行了与退热作用相关的研究。结果显示,SRBC也能显著降低内毒素血症小鼠血清TNF-α水平,并缓解LPS诱导的大鼠发热,甚至展现出优于XBCE的解热作用。为了明确两个药典质控物(柴胡皂苷a和d)在其中的贡献,本研究将二者按它们在提取物中的比例进行混合,获得两个标准品的混合物(MAD)。意外地,MAD既不能抑制LPS诱导的THP-1细胞生成TNF-α,也不能降低内毒素血症小鼠血清中TNF-α的水平。这些结果提示SRBC的提取方式可能更有利于富集柴胡的解热物质,但柴胡皂苷a和d却可能不是其退热物质基础。基于柴胡的退热外周机制,结合单核细胞是全血细胞中分泌TNF-α的主要贡献者,本文将之前初步建立的关联其解表退热功效的生物评价方法做了进一步优化:1)采用人单核细胞株THP-1代替全血细胞来评价柴胡对内生致热原TNF-a的作用;2)将体外补体活化指标聚焦为替代途径补体活化模型。随后,我们利用此优化方法评价了 7个新的柴胡样品(4个北柴胡B-1#～B-4#和3个南柴胡N-5#～N-7#)在解表退热上的质量优劣,综合评分为B-1#>N-6#>N-7#>N-5#>B-3#>B-4#>B-2#。除了排名第一的B-1#正是之前选用的6#陕西北柴胡之外,其余3个南柴胡的表现均优于另外3个北柴胡mucosal immune(柴胡皂苷a和d均高于药典限量标准,且远高于南柴购买Y-27632胡中的含量)。相关性分析表明,7个样品中柴胡皂苷a和d的总含量与生物评价得分不相关(P>0.05),同样提示柴胡皂苷a和d应该不是柴胡的退热物质基础。综上,本研究从解表退热功效所涉病理生理与柴胡体外作用的实际所能出发,首次建立了以多个活性指标组成的柴胡质量生物评价模式和方法,并从6个不同种质柴胡的提取物中选取排名第一的陕西北柴胡开展了其解热作用特点及机制研究。当明确其退热的外周机制后,对之前的生物评价方法进行了优化,并对7个不同产地南北柴胡提取物的解表退热质量进行了评估。从7个样品在该方法中的综合得分与其柴胡皂苷a和d含量无相关性、以及MAD在体内外并不能抑制TNF-α的结果来看,柴胡皂苷a和d可能不是柴胡退热的物质基础。本研究在柴胡质量的生物评价与控制方面开展了有益的探索,可为其他中药质量的生物控制研究提供有价值的借鉴。