大口黑鲈(Micropterus salmoides,Largemouth bass)是我国重要淡水养殖鱼类,其产量以年均9%的速度增长。随着大口黑鲈养殖规模化程度的增加,日益恶化的水体环境导致病害频发,造成重大经济损失。其中,大口黑鲈虹彩病毒(Largemouth bass virus,LMBV)是种苗培育和商品鱼生产中危害最为严重的病原之一,一旦暴发,引起的大口黑鲈死亡率达60%以上。众所周知,免疫防控、药物防控和生态防控是水产养殖病害防控的三大手段,而目前,疫苗研究和应用在我国发展十分缓慢,尤其,LMBV疫苗更是如此,因此,药物防控成为该病害防控最直接、最有效的手段。中草药作为天然产物在自然界中大多易降解、对非靶标生物毒性低、具有抗病毒、抗菌和抗炎等多种药理活性,是抗病毒药物创新的重要药源库。本研究在黄柏、芸香、柴胡等88种中草药的抗LMBV活性筛选的基础上,对具有显著抗病毒活性的黄柏及其活性成分小檗碱(Berberine,BBR)进行了细胞和个体水平的抗LMBV效果评价;进一步采用流式细胞术、透射电镜和Western blot等检测技术初步探究小檗碱的抗病毒机制,以期为开发新型抗LMBV药物提供理论依据。本研究取得结果如下:1.中草药及活性成分抗LMBV活性研究以88种甲醇提取的中草药粗提物为研究对象,黑头软口鲦上皮瘤细胞系(Epithelioma papulosum cyprinid cells,EPC)为细胞筛选模型,通过RT-q PCR检测LMBV的增殖情况,体外筛选出黄柏、五加皮、知母、苍术、牵牛子、车前草、佩兰和芸香8种中草药对LMBV的抑制率超过90%,其中黄柏的抗LMBV活性最佳,抑制率达到99.9%。进一步采用RT-q PCR方法对黄柏主要成分的抗病毒活性分析发现:小檗碱活性最高,抑制率可达99.75%,其次是木兰花碱,抑制率仅34.28%,其中白藓碱、药根碱、吴茱萸碱和吴茱萸次碱对LMBV均无抑制作用;对小檗碱通过RT-q PCR、病毒滴度检测和细胞病变(Cytopathic effect,CPE)观察研究发现:小檗碱可显著降低病毒滴度并抑制LMBV诱导的细胞病变,其半数抑制浓度(Half maximal inhibitory concentration,IC_(50))为11.29μM,表明小檗碱具有良好的体外抗LY2835219体外LMBV活性。2.小檗碱通过线粒体凋亡途径抑制LMBV增殖研究以小檗碱为研究对象,通过细胞荧光染色方法检测其对EPC细胞形态保护效果,发现LMBV感染细胞48h后,细胞大量死亡脱落,细胞膜溶解并伴有细胞核碎裂,而小檗碱处理后与对照组细胞膜形态无明显差异,但仍存在一定的细胞核碎裂现象,表明细胞凋亡在小檗碱抗病毒过程中可能具有重要作用。进一步通过流式细胞术对小檗碱处理的细胞凋亡程度进行检测,发现LMBV感染6 h后小檗碱处理组的细胞凋亡率相对病毒组升高了13.73%,表明小檗碱可以有效诱导LMBV感染EPC细胞的凋亡。利用透射电镜观察EPC细胞内部超微结构发现,小檗碱处理感染细胞6 snail medickh后,细胞内部相对于病毒组出现了明显的细胞凋亡特征,如染色质固缩、细胞骨架崩解、胞膜内陷形成小泡等,表明小檗碱在病毒感染早期诱导细胞凋亡,从而抑制LMBV的增殖。进一步采用RT-q PCR、滴度检测和细胞病变观察验证细胞凋亡对LMBV增殖的影响,发现星形孢菌素(Staurosporine)、依托泊苷(Etoposide)和Z-VAD-FMK均可显著抑制LMBV的增殖并减轻细胞形态的损伤,表明细胞凋亡的调控对LMBV增殖具有重要影响。线粒体膜电位检测结果表明,LMBV感染6 h后,小檗碱处理组EPC细胞的线粒体膜电位相对于病毒组显著降低。进一步通过Western blot检测线粒体凋亡途径关键效应蛋白caspase-9和caspase-3的活化,发现LMBV感染6 h后cleaved caspase-9和cleaved caspase-3表达水平与对照组无显著差异,而小檗碱处理感染细胞后cleaved caspase-9和cleaved caspase-3表达水平显著升高,表明小檗碱降低病毒感染细胞线粒体膜电位,激活线粒体凋亡途径。以上结果表明,小檗碱在LMBV感染过INCB018424分子式程中可能通过线粒体凋亡途径抑制LMBV的增殖。3.小檗碱在体抗LMBV活性研究以大口黑鲈为研究对象,通过注射方式研究LMBV感染量与大口黑鲈累计死亡率的相关性,选择10~3 TCID_(50) LMBV为病毒感染剂量。采用注射给药的方式验证小檗碱在体抗LMBV活性,发现3.93 mg/kg小檗碱治疗后大口黑鲈相对病毒组累计死亡率降低了15%,表明小檗碱可以有效提高LMBV感染后大口黑鲈的存活率。通过RT-q PCR方法检测大口黑鲈肝脏、脾脏和肾脏中LMBV的增殖情况,发现大口黑鲈在LMBV感染1 d和4 d时,小檗碱显著地降低肝脾肾组织中72.13-86.23%的病毒表达量,表明小檗碱可以在病毒感染复制高峰期有效抑制LMBV在大口黑鲈肝脾肾组织中的增殖。同时,小檗碱处理后大口黑鲈的病毒滴度相对于病毒感染组显著降低。以上结果表明,小檗碱有效提高了感染LMBV大口黑鲈的存活率并显著降低鱼体内病毒载量,表现出良好的抗病毒效果。综上所述,本研究发现小檗碱在体外和体内均能有效抑制LMBV增殖,降低感染病毒大口黑鲈的死亡率。同时,小檗碱可能通过线粒体凋亡途径抑制病毒增殖。因此,本研究对中草药抗LMBV活性的研究具有重要意义,为抗LMBV新型药物的研发提供了理论依据。