水稻(OryzaNeurosurgical infection sativa L.)是我国最重要的粮食作物之一。据统计,由强腐生性真菌立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kühn)引起的纹枯病(Sheath blight,ShB)一直是造成水稻产量损失最高的病害,且由于发生面积广和防治频次高,已成为阻碍水稻绿色生产的最重要病害之一。水稻对纹枯病的抗性为典型的数量性状,易受环境影响,研究难度大,国内外迄今报道的具有重要育种应用价值的抗纹枯病数量/相关基因还屈指可数,其抗病机理的深入研究更是鲜见报道。因此,克隆具有重要育种价值的抗纹枯病数量基因并解析其抗病机理不仅有利于人们深入了解水稻抗纹枯病的分子机制,并且对培育抗病品种、保障粮食安全具有重要意义。本实验室前期对178份水稻自然品种的田间纹枯病抗性鉴定表型及基因组重测序数据进行全基因组关联分析,在第11染色体上检测到2个与纹枯病抗性显著关联的SNPs(S94780和S94782)。本研究发现这两个SNPs所在的连锁不平衡区间共预测有24个基因,表达分析显示其中仅有1个基因能快速响应纹枯病菌的侵染,该基因编码G型凝集素样类受体激酶(G-type lectin receptor-like kinase,LecRLK),两个SNPs也分别位于其启动子和编码区,我们暂将该基因命名为SBRR1(sheathblight-resistance RLK1)。结合20个抗病和感病品种中的SBRR1测序数据及靶基因关联分析结果,可将SBRR1分为两种单倍型,即主要来源于相对抗病品种的优异等位变异SBRR1-R和主要来源于相对感病品种的非优异变异SBRR1-S。由于编码区内的一个显著关联SNP并不影响氨基酸变化,因此我们重点分析了启动子变异对SBRR1的影响,启动子荧光素酶实验结果表明,启动子区中的一个256 bp插入片段可能是导致SBRR1-R快速响应纹枯病菌侵染的重要原因。对SBRR1的T-DNA插入突变体sbrr1、敲除系sbrr1-ko及野生型对照DJ(Dongjing)进行纹枯病菌接种鉴定,证实敲除该基因可显著降低纹枯病抗性,相反在DJ和sbrr1突变体中超表达SBRR1均可极显著提高抗性。值得注意的是,在sbrr1突变体中转入pSBRR1-R::SBRR1和pSBRR1-S::SBRR1均可恢复其抗性,但是株系pSBRR1-R::SBRR1/sbrr1的抗性水平及其中的SBRR1诱导表达水平均明显高于pSBRR1-S::SBRR1/sbrr1和野生型DJ对照,相反转入激酶失活突变体pSBRR1-S::SBRR1K553E/sbrr1则不能恢复其抗性。这些结果表明SBRR1-R是一个抗纹枯病优异等位变异,其启动子区的变异Wnt-C59体内实验剂量是决定其优异抗病功能的关键。利用3K水稻品种资源及32份野生稻的基因组信息,发现野生稻均携带非优异等位变异SBRR1-S,所有品种资源中仅有19.4%携带SBRR1-R;籼稻Ⅱ亚群(IND-Ⅱ)带有最高比例的SBRR1-R(56.5%),其次为 IND-Ⅲ(28.8%)、IND-ADM(28.1%)、IND-IB(19.0%)、IND-IA(11.5%),粳稻各亚群带有SBRR1-R的比例均低于10%,温带粳稻(TEJ)中甚至不足1%,表明SBRR1-R最有可能起源于IND-Ⅱ亚群。核苷酸多样性(π)及Tajima’s D分析结果显示,SBRR1-R在IND-Ⅱ亚群品种中受到了自然和/或人工选择,结合该亚群品种主要分布区域的温湿度情况,推测这可能与这些区域更有利于纹枯病严重发生而需要SBRR1-R来增强抗性有关。通过分子标记辅助选择,将SBRR1-R导入江苏两个推广粳稻品种TG394和XD3号中(两品种均携带SBRR1-S),发现导入系在温室的纹枯病病斑长度显著低于对照品种,但在主要农艺性状上无明显差异;进一步利用TG394及其背景下的抗病近等基因系TG394SBRR1-R,发现在纹枯病重发生情况下,SBRR1-R可间接挽回约9.54%的产量损失并有利于减轻稻米品质的变劣程度。这些结果表明SBRR1-R具有较高的育种应用价值。通过酵母双杂交文库筛选及Pulldown和Co-IP等一系列验证实验,鉴定到两个与SBRR1 互作的蛋白 SBRR1-interacting protein 1(SIP1)和 SIP2。SIP1 编码一个锚定蛋白,主要与SBRR1的胞外结构域互作,其敲除系对纹枯病的抗性显著降低,而超表达则显著增强抗性。进一步构建SIP1和SBRR1间的各式遗传材料(sbrr1-ko1/sip1-ko1,sbrr1-ko1/SIP1-OE1和SBRR1-OE1/sip1-ko1),证实SIP1对纹枯病的抗性完全依赖于SBRR1,而SBRR1的抗性发挥需要SIP1。亚细胞定位和蛋白分相检测结果显示,SIP1主要是影响SBRR1蛋白从内质网向细胞膜的高效转运,而SBRR1能否被有效转运至细胞膜直接影响其抗病功能。为进一步探讨SBRR1蛋白上膜与否是如何影响抗病的功能机制,我们分别对sbrr1-ko1和sip1-ko1(SBRR1蛋白绝大部分被滞留在内质网)材料进行了 RNA-Seq分析及酶活测定,发现多个几丁质酶基因表达在两个材料中受到了共同影响;随后测定了携带SBRR1-R的TG394SBRR1-R中的几丁质酶活性,发现其活性在接种后48 h也明显高于携带SBRR1-S的TG394野生型对照。进一步在sbrr1-ko1和sip1-ko1中分别超表达了几丁质酶编码基因OsChit3,发现超表达系显著恢复了两者的纹枯病抗性。这些结果表明SBRR1-R主要是通过快速激活下游几丁质酶基因表达实现纹枯病抗性的显著增强,在这其中需要SIP1将其高效转运至细胞膜以发挥功能。SIP2编码一个2A型蛋白磷酸酶(Proteinphosphatase 2A,PP2A)的调节亚基,与SBRR1胞内激酶域存在直接互作,我们通过基因敲除和超表达,证实其是纹枯病抗性的负调控因子。通过体外磷酸化和去磷酸化实验,初步发现SBRR1不能磷酸化SIP2,但证实SIP2可以去磷酸化SBRR1,推测SIP2可能作为SBRR1激酶活性的负调控因子调控SBRR1的纹枯病抗性功能,但这仍需进一步的遗传材料进行佐证。SIP2本身存在多个磷酸化位点,通过构建各位点的点突变型酵母双杂交分析载体,发现当磷酸化位点P1与P2均处于失活状态的SIP2P1P2不能与SBRR1互作;进一步通过构建相关磷酸化位点持续激活和/或失活的转基因株系,发现SIP2的P1磷酸化位点在其负调控ABT-263浓度纹枯病抗性功能中起到了关键性作用。综上,本研究通过GWAS从水稻自然品种中鉴定到一个具有重要育种应用价值的抗纹枯病优异等位变异SBRR1-R,初步解析了增强纹枯病抗性的分子机制,结果有助于推动水稻抗纹枯病分子育种进程,增加人们对基于优异等位变异的抗纹枯病分子机理的研究认识,具有重要的理论价值和应用前景。