随着细胞遗传学和现代分子生物学的发展,染色体鉴定技术已经从粗放的形态学特征鉴定发展到以DNA为基础的分子细胞学方法鉴定,如原位杂交技术和分子标记等方法,原位杂交技术已成为鉴定小麦及其近缘种染色体的一种最常用方法,但现阶段常用的荧光原位杂交技术常会遇到信号弱的问题。目前有文献报道了一种SABER-FISH(Signal amplification by exchange reaction,SABER)技术,该技术将普通的寡核苷酸探针加上长单链DNA串联体,在串联体上聚集多个互补荧光修饰链以扩增FISH信号,但该技术还没有在植物染色体上尝试。本研究主要是基于SABER-FISH技术,以小麦和黑麦低拷贝寡核苷酸序列、单拷贝寡核苷酸序列作为探针,进行该方法在小麦和黑麦染色体上的应用探索,旨在建立适用于植物染色体低拷贝、单拷贝序列的高分辨率FISH方法。具体结果如下:1RA-mediated pathway.依据文献进行寡核苷酸序列加尾反应的体系探索,明确加尾反应体系中各成分终浓度:1×PBS,10 m M/L Mg SO4,800U/m L Bst LF聚合酶,dATP、dTTP、dCTP各600μM/L,100 n M/L Clean.G haiAlpelisibrpin,50 n M/L Hairpin,10μM/L Primer(pool);2.用已报道的在黑麦和小麦染色体上产生弱信号的探针Oligo-5BL.46、Oligo-5A8080.1、Oligo-4BS、Oligo-5BS、Oligo-5AS、Oligo-5AL进行SABER-FISH方法摸索。在黑麦材料中,染色体经变性处理后,用含10%硫酸葡聚糖(Dextran Sulfate)、50%去离子甲酰胺、2×SSC、0.1%Tween-20的混匀液稀释加尾探针,杂交孵育过夜,结果显示同一探针SABER-FISH的检测信号较ND-FISH检测信号强。在小麦材料中,染色体经变性处理后,用含10%硫酸葡聚糖(Dextran Sulfate)、30%去离子甲酰胺、2×SSC、0.1%Tween-20的混匀液稀释加尾探针,杂交孵育过夜,结果显示同一探针SABER-FISH的检测信号较ND-FISH检测信号强;3.单拷贝序列SABER-FISH检测方法初步探索:(1)筛选长度为30-50 bp的单一特异性寡核苷酸序列加尾处理后作探针,SABER-FISH检测后观察不到明确信号;(2)特异性寡核苷酸序列库(11条序列)加尾处理后作探针进行SABER-FISH检测,在黑麦材料中,染色体经变性处理后,用含10%硫酸葡聚糖(Dextran Sulfate)、50%去离子甲酰胺、2×SSC、0.1%Tween-20的混匀液稀释11条探针,在53°C条件下杂交能观察到微弱的荧光信号,但仍表现出较强的杂信号;低拷贝重复序列利用SABER-FISH技术能够得到很好的检测效果,说明SABER-FISH技术能够应用于植物染色体检测。但对于单拷贝序列,若以单一寡核苷酸序列加尾处理后作探针,SABER-FISH检测不到明确信号;若以特异性寡核苷酸序列库(11条)加尾处理后作探针,SABER-FISH检测能观察到探针信号,但存在STM2457杂信号,针对此方法仍需要进一步优化,突破点在于寻找特异性强的单拷贝寡核苷酸探针。