卵子质膜JUNO蛋白与精子IZUMO1蛋白是哺乳动物精卵融合的必需蛋白。Juno~(-/-)雌性小鼠由于其卵子不能与精子完成精卵融合而导致不育。对人JUNO蛋白的研究发现Trp62突变影响其与IZUMO1蛋白的结合从而影响人的精卵融合。然而,家畜JUNO蛋白的相关研究相对较少。PCI-32765半抑制浓度本文首先通过构建牛JUNO蛋白与IZUMO1蛋白的体细胞表达体系,研究二者结合在牛上的保守性;并通过该体系研究精子获能、顶体反应对JUNO与IZUMO1蛋白结合的影响;最后通过JUNO蛋白Trp62与Leu81的单突变,明确影响JUNO与IZUMO1结合的关键氨基酸位点。本研究推进了牛受精机制的研究进展,为完善牛体外胚胎生产技术体系奠定理论基础。结果如下:首先,通过慢病毒体系构建稳定表达牛JUNO蛋白(HEK293T-JUNO-EGFP)和IZUMO1蛋白(K562-IZUMO1-i RFP)的稳转体细胞系,并通过这两组细胞系进行试验,排除精卵融合中其他受精蛋白的参与,对牛JUNO与IZUMO1蛋白结合的保守性进行验证。1)通过膜Western-blot检测确定JUNO和IZUMO1分别在HEK293T和K562细胞膜上的稳定表达。2)通过牛精子与JUNO蛋白稳转株进行共培养试验,发现牛JUNO稳转株与牛精子的结合能力(100±11.93%)显著高于对照组(38.36±10.19%)(P<0.05)。并且随着添加JUNO抗体浓度的增加,JUNO稳转株与精子的粘附能力显著下降(P<0.05),即JUNO蛋白稳转株中膜表达的牛JUNO蛋白能够与牛精子结合。3)通过流式细胞仪分析检测发现,表达JUNO蛋白的稳转株与IZUMO1蛋白稳转株之间的结合能力(31.13±0.32%)显著高于对照组(EGFP)与IZUMO1稳转株的结合能力(16.76±0.74%)(P<0.05),进一步验证了牛JUNO-IZUMO1蛋白相互作用的特异性和保守性。其次,本试验研究了牛精子获能和顶体反应对JUNO与IZUMO1结合能力的影响。1)通过金霉素染色探究牛精子最佳获能时间,发现获能90min组与120min组(95.49±2.54%、96.71±1.72%)结果显著高于60min(86.85±7.02%)(P<0.05);2)通过溶血卵磷脂胆碱诱导精子顶体反应,并通过花生凝集素染色对精子顶体反应进行筛选,结果显示发生顶体反应的精子比率15min处理组(82.09±12.22%)显著高于5min组(51.40±12.41%)(P<0.05)。3)最终以获能90min、顶体反应15min为精子最佳反应时间,进行精子与牛JUNO蛋白稳转株进行共培养。结果显示,随着精子获能与顶体反应的完成,其与JUNO蛋白结合能力显著上升(27.48±11.30%、63.53±13.43%、100±4.41%)(P<0.05)。4)为探明精子获能和顶体反应对IZUMO1与JUNO结合能力影响的原因,我们研究了获能和顶体反应精子IZUMO1的定位变化selleck Ceralasertib。通过精子IZUMO1蛋白免疫荧光结果显示,IZUMO1蛋白自获能开始由质膜中释放出来,并于顶体反应开始后向赤道带进发,最终重新定位到赤道带上完成精子顶体反应。遂推测IZUMO1的释放与重新定位是精子上IZUMO1与JUNO蛋白结合的前提。最后,通过分别单突变牛JUNO蛋白Trp62与Leu81,明确了影响JUNO与IZUMO1结合的关键氨基酸位点。1)将表达牛JUNO蛋白W62A及L81A单突变的细胞与IZUMO1稳转株进行共培养,并通过流式细胞仪鉴别JUtype 2 pathologyNO蛋白Trp62与Leu81位点突变后对JUNO-IZUMO1结合的影响。W62A及L81A单突变与IZUMO1稳转株结合能力(95.65±7.87%、64.83±2.29%)显著低于牛野生型JUNO蛋白(131.71±20.30%)。2)对分别表达牛JUNO蛋白突变体的两种细胞与精子共培养,发现较正常牛JUNO蛋白(100±20.14%)相比,JUNO W62A及JUNO L81A单突变与牛精子粘附能力(48.30±8.08%、52.44±1.96%)显著下降(P<0.05)。综上所述,我们得出:1)牛JUNO蛋白是精子受精蛋白IZUMO1的受体,二者结合不需要其他受精蛋白的参与。2)牛精子受精蛋白IZUMO1通过获能及顶体反应重新分布到赤道带上,才能与卵子表面的JUNO蛋白结合。3)JUNO蛋白Trp62与Leu81位点是牛JUNO与IZUMO1蛋白结合的关键氨基酸位点。