黄鳝(Monopterus albus),俗称鳝鱼,是我国重要的经济鱼类。黄鳝具有性逆转的特殊生物学特征,国内外对该方面的研究较多,而对其体色方面的研究较少。已有研究表明,不同体色黄鳝在生长速度、繁殖力和肌肉营养成分等方面均存在差异。根据本课题组前期对黄鳝不同体色群体进行全基因组关联分析,发现csf1r基因可能与黄鳝体色形成有关。而在斑马鱼中的研究发现,csf1r在维持黄色素细胞正常发育中是必不可少的,同时也对斑马鱼黑色条纹正常发育起到至关重要作用。本研究以黄鳝为研究对象,通过基因时空表达特征及CRISPR/Cas9基因编辑技术对csf1r在黄鳝体色形成中的功能进行初步探讨,主要研究结果如下:1.黄鳝csf1r基因的克隆和时空表达特征研究本研究采用RACEs(Rapid-amplifichepatocyte-like cell differentiationation of c DNA ends)技术克隆得到了csf1r基因的全长c DNA序列,对其编码蛋白进行生物信息学分析;采集黄鳝不同组织及不同发育时期样品,利用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)方法检测csf1r基因在黄鳝不同组织、胚胎不同发育时期及3种体色黄鳝(黄黑斑鳝、碎花斑鳝和隐花斑鳝)皮肤中的相对表达量,分析该基因的表达特征。黄鳝csf1r全长c DNA序列长度为4430 bp(Gen Bank收录号:OP589303),其编码区长度为2937 bp,编码978个氨基酸,ICI 46474细胞培养存在免疫球蛋白结构域和蛋白激酶催化结构域2个保守结构域。荧光定量PCR结果表明,csf1r基因在黄鳝脑、精巢、卵巢、肠、心、肾、肝、肌肉、皮肤和脾等组织中均有表达,在脾和心中表达量较高,其次是肾、皮肤和肌肉,卵巢中表达量最低;csf1r在胚胎眼晶体形成期开始大量表达,而显微观察发现该时期胚胎的躯干上开始有色素颗粒出现。以上结果表明csf1r基因可能不仅参与了黄鳝体色的形成,还与黄鳝非特异性免疫相关。2.黄鳝csf1r基因的功能验证以CRISPR/Cas9基因编辑技术构建csf1r基因缺失的黄鳝突变体。根据黄鳝csf1r基因序列,设计两个靶点合成sg RNA,体外切割实验结果表明sg RNA csf1r-87和csf1r-513两个靶点均能实现基因敲除。将合成的两个sg RNA分别与Cas9蛋白按1μL混合液中包含100 ng的g RNA、0.2μL的Cas9蛋白(1μg/μL)的比例混合,在selleck激酶抑制剂二细胞期前通过显微注射至黄鳝受精卵。通过表型观察筛选出3条出现明显体表花纹缺失情况的黄鳝(命名为M1、M2和M3),M1和M3相较于M2体表花纹缺失更严重,出现大面积色素缺失,不能形成良好的条纹模式。提取野生型和3条突变体黄鳝的DNA及RNA,利用特异性引物进行PCR克隆和Sanger测序结果显示,不管在DNA水平还是m RNA水平,突变体黄鳝中均有多种不同的突变类型,包括碱基突变、小片段缺失、较大片段缺失和碱基插入等,其中绝大多数突变类型造成了csf1r基因移码突变,从而使得编码的蛋白出现异常。根据石蜡切片显微照片发现,野生型黄鳝皮肤具有明显的表皮层,表皮层中分布有大量粘液细胞,而突变体黄鳝的表皮层明显变薄,表皮层中的粘液细胞变少甚至几乎没有。综上所述,csf1r基因在黄鳝体表条纹模式的形成和免疫能力中发挥重要作用。