研究目的:生长激素及其类似物是内源性肽类禁用物质,具有影响脂肪代谢和促进蛋白合成的作用,被世界反兴奋剂机构(World Anti-Doping Agency,WADA)列为S2(肽类激素、生长因子相关物及其类似物)类物质,赛内赛外均禁用。生长激素因为滥用程度高,检测难度大而受到持续关注。目前,WADA认可的生长激素检测方法包括直接检测法和间接检测法,直接检测法是采用免疫试剂盒直接检测22 kDa亚型的生长激素和非22 kDa亚型的生长激素,通过生长激素不同亚型的比例变化超过一定的阈值,判断兴奋剂生长激素阳性。由于抗原抗体存在交叉反应,准确度仍需进一步加强。间接检测法则是检测生长激素摄入后人体内升高的两个生物标志物IGF-I和P-III-NP,使用质谱方法或者免疫方法检测,代入公式计算相应数值,超过阈值判断兴奋剂生长激素阳性。本研究旨在使用准确度更高的质谱技术直接检测兴奋剂生长激素,提高检测方法的准确度,为兴奋剂生长激素的直接检测提供方法选择。研究方法:1)样本制确认细节备:使用黄色帽真空管取坐位采集生理状态下的受试者和生长激素注射后4小时的受试者血液,4oC,3500 rpm离心15分钟,取上清,获得200μL/管的血清样本,剩余样本存放在-80oC冰箱。2)拧去BioRAD低丰度蛋白富集试剂盒内小柱的帽子和底塞,1000g离心1分钟,弃去流出液。3)活化小柱:向小柱内加200μL wash buffer,旋转5分钟,1 000g离心1分钟,弃去流出液,重复该步骤一次。4)将200μL血清样品加入到小柱内,室温旋转孵育2小时,1 000g离心1分钟,弃去流出液。5)清洗小柱:向小柱内加200μL wash buffer,旋转5 min,1 000g离心1分钟,弃去流出液,重复该步骤两次。6)清洗小柱:向小柱内加200μL DI water,旋转5分钟,1 000g离心1分钟,弃去流出液。7)收集样本:向小柱内加40μL rehydrated elution reagent,多次涡旋、旋转,时长超15分钟,1 000g离心1分钟,取干净EP管收集流出液,重复该步骤两次。8)溶液置换:将样本加入到10 K超滤管内,加入50 mM碳酸氢铵至超滤管口,14 000g高速离心20分钟,弃去流出液,重复该步骤三次。9)收集样本:将10 K超滤管倒扣在新的EP管内,3000 g离心,收集流出液。10)加入三(2-羧乙基)膦盐酸盐,使其工作浓度为10 mM,加入氯乙酰胺,使其工作浓度为40 mM,56oC避光反应50分钟。11)使用Implen NanoPhotometer?N120蛋白定量,吸光度A=280纳米。12)以蛋白:胰酶=50:1(质量比)加入胰酶,37oC 600 rpm孵育4小时。13)以蛋白:胰酶=50:1(质量比)加入胰酶,37oC 600 rpm孵育12小时。14)使用Spin Mono C18小柱脱盐:加200μL 100%乙腈活化小柱,室温3 000g离心1分钟,弃去流出液;加200μL 50%乙腈活化小柱,室温5 000g离心1分钟,弃去流出液;加200μL 0.1%三氟乙酸平衡小柱,室温5 000g离心1分钟,弃去流出液;将样品真空抽干,使用80μL 0.1%三氟乙酸复溶,加入20%三氟乙酸调节,使得样品PH<3。将样品加到小柱内,室温3 000g离心1分钟,重复2次,弃去流出液;加300μL 0.1%三氟乙酸到小柱内清洗杂质,室温5 000g离心2分钟,弃去流出液;加100μL含20%乙腈0.1%三氟乙酸水溶液到小柱内洗脱,室温3 000g离心1分钟,重复1次,收集流出液。加100μL含50%乙腈0.1%三氟乙酸水溶液到小柱内洗脱,室温3 000g离心1分钟,重复1次,收集流出液。加100μL含80%乙腈0.1%三氟乙酸水溶液到小柱内洗脱,室温3 000g离心1分钟,重复1次,收集流出液。15)真空抽干,将烘干的肽段用80μL流动相A(2%乙腈加入氨水,PH=10.0)复溶,取至塑料进样小瓶,上样量为70μL,使用装有ACQUITY UPLC?BEH·C18色谱柱(1.7·μm,2.1·mm×150·mm)的超高效液相色谱仪(Vanquish·Flex,USA)按梯度进行分级。色谱梯度:0-2分钟流动相B为0%,2-18分钟流动相B为3.8%,18-35分钟流动相B为24%,35-38分钟流动相B为30%,38-39分钟流动相B为43%,39-45分钟流动相B为100%,45-66分钟流动相B为0%,流速为0.2 mL/min,流动相B为80%乙腈加入氨水,PH=10.0,自动进样器和柱温分别设置为10℃和35℃,从19分钟开始,每分钟收集1管流出液,至45分钟停止收集,共25管液体。16)氮气吹干,使用2%乙腈0.1%三氟乙酸购买Emricasan复溶,通过Thermo Ultimate U3000纳流液相色谱串联Thermo Orbitrap Exploris 480质谱仪进行正离子数据依赖采集模式(Data Dependent Acquisition,DDA)和平行反应监测模式(Parallel Reaction Monitoring,PRM)数据采集,喷雾电压为2200 V,离子传输管和离子源温度为350oC,打开内部质量校准Easy-IC~(TM)。17)Thermo Ultimate U3000纳流液相色谱条件:色谱柱使用德国迈克纳升色谱柱填料(r119.aq.0003)自填充C18色谱柱(1.9μm,75μm×200 mm)。流动相A为0.1%甲酸的质谱级纯水,流动相B为含80%乙腈(含0.1%甲酸),洗针液为含50%乙腈(含0.1%甲酸)。Thermo Ultimate U3000色谱梯度:0-4分钟流动相B为5%,4-5分钟流动相B为10%,5-40分钟流动相B为37%,40-60分钟流动相B为70%,60-67分钟流动相B为98%,67-68分钟流动相B为5%,流动相流速为0.3μL/min,柱温箱温度为58℃,上样体积1μL。研究结果:该方法对兴奋剂22kDa生长激素特征肽段(LHQLAFDTYQEFEEAYIPK)的定量限为1-100 ng/mL,medicine shortage总生长激素肽段(SNLELLR)的定量限为0.05-100 ng/mL。加标样本回收率在80%-115%之间,批内精密度和批间精密度RSD均小于15%。生理状态下,10名受试者的生长激素22kDa特征肽段与生长激素的比值在0.000922-0.145044,10名男性注射生长激素药物的受试者在药物注射4小时后生长激素22kDa特征肽段与生长激素比值在1.854898-17.62041。研究结论:建立了大分子蛋白兴奋剂生长激素的液相色谱-高分辨质谱检测方法,该方法能在少量男性受试者中成功区分未注射生长激素的生理状态血清样本和生长激素药物注射后四小时的血清样本,补充了兴奋剂生长激素的检测方法。