1目的姜科植物阳春砂Wurfbainia villosa(旧学名:Amomum villosum)是岭南道地药材之一,寻找更多其入药部位为干燥成熟的果实,主要药效物质挥发油中富含乙酸龙脑酯、樟脑、龙脑等萜类化合物。前期研究已经从阳春砂中克隆并鉴定了龙脑基二磷酸合酶(bornyl diphosphate synthase,BPPS),该酶以香叶基二磷酸(geranyl diphosphate,GPP)为底物,经脱磷酸后生成龙脑,GPP由香叶基二磷酸合酶(geranyl diphosphate synthase,GPPS)催化产生,因此GPPS和BPPS都是阳春砂萜类下游合成途径中的关键酶。GPPS属于反式异戊烯基二磷酸合酶家族(trans-isopentenyl diphosphate synthases,TIDS)。本研究一方面基于阳春砂基因组和转录组数据,利用生物信息学方法对阳春砂中的TIDS家族进行全基因组范围鉴定,从中筛选候选基因并进行克隆和功能鉴定,以期获得产生GPP的GPPS,进一步解析阳春砂中PCI-32765种子团富含单萜的分子基础;另一方面利用本课题组已获得的具有种子表达特异性的Wv BPPS启动子、经过功能优化的突变体Wv BPPS-Y513A和Wv BPPS分别构建相应的真核表达载体,在烟草中进行种子特异表达或组成型表达,以期在烟草中引入龙脑的生物合成途径,为Wv BPPS应用于挥发性萜类代谢工程提供依据。2方法2.1基于阳春砂基因组和转录组的TIDS家族全基因组范围鉴定利用已经报道的TIDS家族基因氨基酸序列在阳春砂的全基因组数据库中进行本地BLAST;在Pfam蛋白数据库检索其对应的隐马尔可夫模型(hidden Markov models,HMM),整合本地BLAST和HMMER检索结果,上传NCBI进行Conserved Protein Domain Family(CDD)检索,结合MEME motif预测分析结果,以是否具备保守motif和全长开放阅读框为筛选条件,筛选阳春砂的TIDS家族基因并进行生物信息学分析。2.2阳春砂中候选TIDS家族基因的筛选、克隆与功能鉴定结合阳春砂TIDS家族生物信息学分析,以及TIDS家族基因在不同组织器官转录组中的表达量,优先选择预测具有GPPS功能的基因作为候选Wv TIDS家族基因。以候选基因表达量较高的组织部位c DNA为模板进行基因克隆,采用原核表达体系进行融合蛋白诱导与表达,纯化后的蛋白按照文献中报道的方法进行体外酶促反应,气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)检测其催化产物,并对有功能的基因重新命名。2.3实时荧光定量PCR设计用于q PCR的引物,以阳春砂不同组织部位的根状茎、叶、花和果实(60DAF的果皮和种子团)的c DNA为模板进行q RT-PCR,基因表达水平以2-~(△△)CT进行归一化处理。2.4阳春砂BPPS转化烟草的研究将在pLB克隆载体上克隆成功的Wv BPPS与突变成功的Wv BPPS-Y513A质粒构建到切除GUS基因的真核表达载体,使用p CAMBIA-1301自带的35S启动子;同时将克隆成功的包含截短的种子特异性启动子在内的Wv BPPS全长质粒构建到切除35S启动子的真核表达载体,使用Wv BPPS的种子特异性启动子。重组表达载体质粒转化农杆菌,用叶盘法侵染烟草,提取生根后的烟草叶片g DNA验证目的基因是否转入,提取成熟期烟草的叶片/种子RNA并反转录为c DNA验证目的基因是否表达,最后提取阳性烟草株系的挥发性成分,GC-MS检测产物。3结果3.1阳春砂中TIDS家族的全基因组范围鉴定结合已报道TIDS本地BLAST结果与PF00348在Pfam数据库检索结Dynamic membrane bioreactor果,从阳春砂基因组中鉴定到13个TIDS家族基因,系统发育分析显示,13个Wv TIDS被分为5个分支:TIDS-a、TIDS-b、TIDS-c、TIDS-d和TIDS-e。基于上述基因在阳春砂转录组中的表达量和基因共线性分析,选择其中7条基因做为候选Wv TIDS基因,即Wv TIDS3、Wv TIDS4、Wv TIDS5、Wv TIDS7、Wv TIDS9、Wv TIDS10和Wv TIDS13。3.2阳春砂中候选TIDS家族基因的克隆和功能鉴定7个候选TIDS家族基因均克隆成功,其中Wv TIDS13构建双His标签p ET32a重组原核表达载体,其余6个TIDS基因均构建MBP标签p MAL-c5x重组原核表达载体。通过原核表达和蛋白纯化,成功获得7个基因的融合蛋白,其中Wv TIDS3、Wv TIDS5和Wv TIDS7鉴定为阳春砂中的同源二聚体GPPS,重新命名为Wv GPPS1、Wv GPPS2、Wv GPPS3;Wv TIDS13鉴定为阳春砂中的法尼基二磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase,FPPS),其主产物为法尼基二磷酸(farnesyl diphosphate,FPP),同时可以产生少量GPP,重新命名为Wv FPPS;预测为阳春砂中异源二聚体香叶基二磷酸合酶大亚基(large subunit of geranyl diphosphate synthase,GPPS.LSU)的Wv TIDS4和Wv TIDS9分别与预测为异源二聚体香叶基二磷酸合酶小亚基(small subunits of geranyl diphosphate synthase,GPPS.SSU)的Wv TIDS10一起反应,均未检测到产物。3.3已鉴定功能Wv TIDS表达模式分析4个已鉴定功能Wv TIDS基因在阳春砂不同组织部位中表达量分析的结果表明,Wv GPPS1、Wv GPPS2、Wv GPPS3和Wv FPPS在种子团中均有表达量,而这4个基因均可以催化IPP和DMAPP生成GPP,这或许是阳春砂种子团富含单萜的分子基础之一,阳春砂种子团中单萜前体GPP的积累或许是3个同源二聚体GPPS协同发挥作用的结果。3.4阳春砂BPPS转化烟草的研究3种重组转基因载体转化烟草均获得相应的转基因阳性烟草,并且目的基因均成功表达。利用载体自带35S启动子的Wv BPPS在其中7株转基因烟草中表达,E-Wv BPPS(Wv BPPS-Y513A突变体)在其中5株转基因烟草中表达;包含Wv BPPS种子特异性启动子的全长Wv BPPS在其中6株转基因烟草中表达。虽然上述Wv BPPS均在转基因烟草中表达,但GC-MS未检测到相应的龙脑产物。4结论本研究基于阳春砂基因组和转录组的信息,利用生物信息学分析的方法,对阳春砂中的TIDS家族基因进行了全基因组范围内的鉴定,有3个同源二聚体GPPS被鉴定,唯一1个FPPS可以催化底物生成FPP和GPP。阳春砂种子团中的单萜前体GPP是由同源二聚体GPPS催化生成的。Wv BPPS转化烟草的研究中,获得目的基因成功表达的阳性烟草植株,烟草阳性转化率较高,但未检测到目标产物。