研究背景侵袭性真菌感染主要包括侵袭性念珠菌病、侵袭性烟曲霉病等,在免疫缺陷患者中具有高发病率和死亡率,严重危害患者的生命安全。其中,白念珠菌和烟曲霉是侵袭性真菌感染中非常重要的两种真菌病原体。宿主巨噬细胞在抗真菌感染中发挥重要作用,对巨噬细胞的抗真菌免疫机制研究非常重要。自噬是一种保守的细胞应激反应,在抗感染免疫反应中发挥重要作用。真菌感染可以诱导巨噬细胞自噬,有助于胞内真菌清除,从而消除感染。自噬过程包括吞噬泡形成、自噬体形成、自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体、自噬溶酶体降解等4个步骤;自噬流是这些步骤在细胞内连续出现的动态过程,常用来评价细胞自噬是否行使正常功能。目前有研究证实烟曲霉可诱导巨噬细胞自噬,但是关于烟曲霉early antibiotics对巨噬细胞基础自噬流的影响尚无定论。焦亡是一种比较新的程序性死亡方式,近些年来焦亡已成为感染领域的研究热点。既往关于细胞焦亡的研究主要是关注细菌和病毒感染,但越来越多的证据表明,焦亡在真菌感染中也发挥着关键作用。目前尚关于无烟曲霉及白念珠菌诱导巨噬细胞焦亡的直接证据,关于烟曲霉及白念珠菌能否直接诱导巨噬细胞焦亡以及焦亡发生的生物学意义仍不明确。研究目的本研究的主要目的是,探索烟曲霉对小鼠巨噬细胞自噬流的影响;通过体外及体内实验对烟曲霉能否诱导巨噬细胞焦亡进行初步研究,并初步探索巨噬细胞焦亡在烟曲霉系统感染中发挥的作用以及焦亡的发生机制;通过体外实验对白念珠菌诱导小鼠巨噬细胞焦亡进行初步研究。研究方法1.烟曲霉体外刺激小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)不同时间,免疫印迹法(WB)检测自噬关键蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC3)-Ⅰ型/Ⅱ型的转换及磷酸化雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)Ser2481的蛋白水平;烟曲霉和溶酶体阻断剂单独或联合体外刺激BMDMs不同时间后,WB检测LC3-Ⅱ蛋白水平。2.烟曲霉体外刺激BMDMs后,活细胞工作站观察细胞焦亡样形态;实时荧光定量PCR(qRTPCR)检测NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白(NLRP3)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)mRNA表达水平;WB检测NLRP3、胱天蛋白酶-1(caspase-1)、Gasdermin D(GSDMD)的表达水平;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-1β、IL-18分泌水平;敲除GSDMD后,检测焦亡指标的变化。3.构建烟曲霉系统感染模型,比较WT小鼠及GSDMD KO小鼠的生存时长、体重变化、脏器菌载量,WB检测WT小鼠各脏器的GSDMD表达水平,WB检测WT小鼠及GSDImidazole ketone erastin纯度MD KO小鼠脾脏巨噬细胞的NLRP3、caspase-1、GSDMD表达水平,ELISA检测WT小鼠血液及脾脏匀浆的IL-1β、IL-18水平。4.分别抑制THP-1巨噬样细胞的NLRP3、caspase-1、树突细胞相关性C型凝集素 1(Dectin-1)、膜结合 Toll 样受体(TLR)2、TLR4、核转录因子 kappaB(NF-κB)、胞外信号调节激酶(ERK 1/2),再行烟曲霉体外刺激THP-1巨噬样细胞,通过WB检测GSDMD表达水平。5.白念珠菌体外刺激BMDMs后,活细胞工作站观察细胞焦亡样形态,qRT PCR检测 NLRP3、IL-1β、IL-18 mRNA 表达水平,WB 检测 NLRP3、caspase-1、GSDMD的表达水平,ELISA检测IL-1β、IL-18分泌水平,流式细胞术比较WT及GSDMD KO BMDMs对白念珠菌的吞噬率,流式细胞术及LDH释放法分别比较WT及GSDMD KO BMDMs的死亡率,IL-1β预处理BMDMs后再行白念珠菌刺激,观测BMDMs死亡率是否较单纯白念珠菌感染组下降。研究结果1.烟曲霉体外刺激可引起小鼠巨噬细胞LC3-Ⅱ表达水平随时间逐渐升高,各溶酶体阻断剂处理后可使LC3-Ⅱ水平进一步升高。2.体外实验证明烟曲霉感染巨噬细胞后,巨噬细胞可以出现焦亡特征性表现,而敲除GSDMD后,无法诱导焦亡发生。3.在体实验中,小鼠系统感染烟曲霉后,与GSDMD KO小鼠相比,WT小鼠存活率更高、脏器菌载量更低;WT小鼠多个脏器均发生焦亡;WT小鼠脾脏巨噬细胞发生炎症小体活化及焦亡,而GSDMD敲除小鼠未发生上述变化。4.分别抑制 NLRP3、caspase-1、Dectin-1、TLR2、TLR4、NF-κB、ERK 1/2 后,再行烟曲霉体外刺激THP-1巨噬样细胞,发现焦亡被抑制。5.白念珠菌体外刺激可引起小鼠巨噬细胞焦亡,而敲除GSDMD后,无法诱导焦亡发生;与WT组相比,GSDMD KO组巨噬细胞对白念珠菌的吞噬率更低,死亡率更高;IL-1β预处理巨噬细胞后再行白念珠菌刺激,可使巨噬细胞死亡率降低。研究结论1.烟曲霉体外刺激可增加小鼠巨噬细胞基础自噬流。2.烟曲霉可以诱导巨噬细胞发生焦亡,敲除GSDMD后,无法诱导焦亡发生;烟曲霉系统感染可以诱导小鼠焦亡发生,且焦亡可能发挥了抗感染保护作用。3.NLRP3-caspase-1-GSDMD是烟曲霉诱导巨噬细胞焦亡的炎症小体通路,烟曲霉诱导巨噬细胞焦亡可能通过Dectin-1/TLR2/TLR4受体激活巨噬细胞,并传递信号,激活其下游NF-κB通路、ERK 1/2丝分裂原活化蛋白激酶(VX-765MAPK)通路蛋白,从而激活焦亡。4.白念珠菌可诱导巨噬细胞发生焦亡;焦亡的发生可促进IL-1β释放,并通过提高巨噬细胞的免疫活性,降低巨噬细胞死亡率。