α-熊果苷(α-arbutin)是一种对苯二酚(Hydroquinone)的糖基化衍生物。α-熊果苷因其作用机制广泛,常用于化妆品行业及临床药物治疗。酶法和全细胞转化法是α-熊果苷的主要生产方法,而低催化效率的酶限制了α-熊果苷的生产。本研究以Leuconostoc mesenteroides来源的蔗糖磷酸化酶(Sucrose phosphorylase,SPase)为出发点,结合半理性酶改造与α-熊果苷的合成工艺优化,实现了α-熊果苷的5 L发酵罐高效生产。主要研究结果如下:(1)将基因gtfA分别导入至大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌中。优化各宿主菌株的全细胞转化菌体量,在转化24 h后,B.subtilis 168/p MA5-gtfA的α-熊果苷产量高达80.9 g·L~(-1),摩尔转化率为81.6%,是E.coli BL21/p ET28a-gtfA产量(27.9 g·L~(-1))的2.9倍。(2)测定野生型蔗糖磷酸化酶的酶学性质,其比酶活为48.6 U·mg~(-1)。针对酶活力不高的问题,利用计算机模拟半理性设计突变点,以筛选酶活力较高的突变体。首先通过分子对接结果得到潜在的有益突变点R137、F160和L337位点。对这三个位点建立饱和突变文库,筛选得到一株酶活性为野生型161%的突变体R137F。(3)对突变体酶R137F和野生型酶进行分子动力学模拟和动力学参数测定。R137F对底物对苯二酚的K_m比野生型降低了近2.4倍,k_(cat)/K_m比野生购买diABZI STING agonist型提高了4.6倍;同时,R137F的Rgut infectionMSF高于野生型,表明R137F突变体蛋白结合口袋的灵活性增加,这解释了突变体酶催化效率提高的原因。(4)经验证,重组菌株B.subtilis 168/p MA5-gtfA_(R137F)的α-熊果苷产量为原始菌株B.subtilis 168/p MA5-gtfA的1.2倍。优化重组菌株B.subtilis 168/p MA5-gtfA_(R137F)的全细胞转化条件,其最适反应条件如下:p H 7.0,温度30℃,菌体浓度OD_(600)为50;初始对苯二酚浓度为45 g·L~(-1),对苯二酚采用分批投料方式添加。转化条件优化后的α-熊果苷产量为107.9 g·L~(-1),摩尔转化率为87.3%。(5)在最适全细胞转化条件下,将重组菌株B.subtilis 168/p MA5-gtfA_(R137F)置于5L发酵罐中转化24 h,最终α-熊果苷的产量为119.3 g·L~(-1),摩尔转化率为96.5%,相比原始菌株B.subtilis 168/p MA5-gtfAntineoplastic and I抑制剂A的产量提升了47.5%。