研究背景衰老细胞发生不可逆的增殖停滞,表现出高代谢活性,并抵抗细胞凋亡。衰老细胞具有独特的形态和分子特征及功能,使其与其他非分裂细胞群(如静止细胞和终末分化细胞)区分开来。细胞衰老的特征包括细胞周期停滞、转录改变、获得衰老相关分泌表型(Senescence-associated secretory phenotypes,SASP)、大分子损伤和代谢失调等。研究发现,各种免疫细胞群体都可经历细胞衰老的过程,呈现细胞衰老的特征,如细胞周期抑制因子P16、P21表达上调,SASP增多及衰老相关-β半乳糖苷酶(Senescence-associated β-galactosidase,SA-β-GAL)活性升高等。巨噬细胞是可塑性最强的免疫细胞,巨噬细胞在组织稳态和炎症中发挥关键作用,并参与癌症和各种炎症性疾病等多种疾病的发展。研究表明,老年小鼠腹腔巨噬细胞呈异质性和拉长的形态,细胞周期抑制因子P53/P21的表达增强,SA-β-GAL活性增强,目前关于巨噬细胞衰老的研究还不够深入。组织居留的巨噬细胞被认为是长寿的巨噬细胞,研究显示,T细胞免疫球蛋白及粘蛋白-4(T-cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 4,Tim-4)在肝脏、肠道、脂肪、心脏、肌肉等多个器官组织居留巨噬细胞中高表达。Tim-4是Tim家族的一员,被鉴定为磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)受体,参与巨噬细胞对凋亡细胞的胞葬作用。Tim-4在维持巨噬细胞稳态、调控巨噬细胞功能中发挥不可或缺的作用。文献报道,Tim-4可参与诱导肿瘤免疫耐受,可异位表达于肿瘤细胞并促进肿瘤细胞的增殖和干性。本实验室前期发现,Tim-4可通过LKB1激活AMPK诱导巨噬细胞自噬。文献报道,自噬与衰老密切相关,老年人单核细胞中Tim-4表达降低,但Tim-4在巨噬细胞衰老中的作用尚不清楚。本研究利用利用自然衰老的小鼠、野生型(Wild Type,WT)以及Tim-4基因敲除(Tm-4 Knock Out,Tim-4KO)小鼠,初步探讨了 Tim-4在巨噬细胞衰老中的作用及机制。研究方法与结果1.衰老巨噬细胞中Tim-4的表达降低。利用自然衰老的小鼠,我们发现Tim-4+居留的腹腔巨噬细胞(Peritoneal macrophages,PEMs)随年龄增加比例降低;肝组织中Tim-4的表达也随年龄增加而降低;利用磁珠分选肝脏巨噬细胞,发现衰老后肝脏巨噬细胞Tim-4的表达也降低。体内和体外的研究表明,肿瘤微环境抑制Tim-4的表达,并且肿瘤微环境刺激下,巨噬细胞呈现衰老表型。2.Tim-4缺失PEMs呈现衰老表型。分离WT以及Tim-4 KO小鼠的PEMs确认细节进行RNA-seq,KEGG富集到与细胞衰老相关的细胞周期以及P53信号通路,qRT-PCR结果发现,Fer-1细胞培养衰老相关指标P21 Cip1、Tp53表达上调,Laminb1表达降低;SA-β-GAL活性升高;在LPS刺激下,Tim-4 KO小鼠的PEMs细胞周期进程受阻;Tim-4缺失PEMs呈现衰老表型。3.Tim-4缺失后肝脏巨噬细胞呈现衰老表型。相较于WT小鼠,我们发现Tim-4KO小鼠肝组织中衰老相关指标P21、P53的表达上调;利用F4/80磁珠分选肝脏巨噬细胞,Western blotting结果显示肝脏巨噬细胞中P21、P53的表达也上调;流式细胞术检测结果显示,Tim-4缺失后肝脏中的两群巨噬细胞即F4/80hi CD11blow居留的枯否氏细胞(Kupffer Cells,KCs)和 F4/80low CD11bhi 单核细胞来源的巨噬细胞(monocyte-derived macrophages,MoMφs)SA-β-GAL的活性均升高,Tim-4缺失的肝脏巨噬细胞呈现衰老表型。4.Tim-4 缺失后骨髓来源的巨噬细胞(Bone marrow-derived macrophages,BMDMs)呈现衰老表型。我们分离WT及Tim-4KO小鼠的BMDMs,qRT-PCR结果显示,Tim-4 KO组BMDMs中衰老相关指标P21Cip1、Tp53表达显著上调。免疫荧光结果显示,Tim-4 KO组DNA损伤指标γ-H2AX表达上调、SA-β-GAL活性升高。以上结果表明,Tim-4缺失后BMDMs呈现衰老表型。5.Tim-4缺失导致巨噬细胞色氨酸代谢受损。对WT及Tim-4 KO KCs进行RNA-seq,通过KEGG以及GSEA分析,发现色氨酸代谢通路显著富集。色氨酸是NAD+从头合成途径的底物,Ido1、Ido2、Kmo、Qprt、Kynu为NAD+从头合成途径中的关键酶。qRT-PCR检测结果显示,Tim-4缺失后,KCs细胞中NAD+从头合成途径中关键酶的表达降低,NAD+消耗酶Cd38无明显变化。巨噬细胞体外过表达Tim-4,Ido1显著上调,提示Tim-4可能通过影响色氨酸代谢从而调控细胞NAD+水平,进而调控巨噬细胞向衰老表型的转变,具体机制有待深入研究。研究结论及意义本研究发现衰老巨噬细胞中Tim-4的表达降低,Tim-4缺失后巨噬细胞呈现衰老样表型,Tim-4调控巨噬Electrophoresis细胞衰老可能与色氨酸代谢通路有关。本研究初步揭示了 Tim-4在巨噬细胞衰老中的作用,为Tim-4在组织稳态中的功能研究提供新的思路,具有重要理论研究价值。