更多【目的】1.分离、培养SD大鼠的骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),并验证其成骨、成脂的分化能力。2.经SD大鼠尾静脉注射阿霉素(adriamycin,ADR)至体内,建立慢性肾病大鼠CKD(Chronic kidney disease,CKD)模型。3.经CKD大鼠肾动脉将BMSCs移植到肾组织,探讨其是否能改善CKD大鼠肾功能,阻止慢性肾病肾组织细胞凋亡和抑制慢性肾病进程中的炎症反应。【方法】1.分离培养BMSCs,并检测成骨、成脂分化能力断颈处死2只SD大鼠,在无菌的条件下取双侧股骨和胫骨,用无菌磷酸盐缓冲液浸泡后用添加10%胎牛血清的L-DMEM培养液反复冲洗骨髓腔,去除可见的大块组织后反复清洗、吹打细胞直至分散,通过离心后,收集BMSCs,并进行传代培养。对BMSCs进行成骨、成脂的诱导分化,进行染色和荧光观察并记录。2.阿霉素诱导SD大鼠建立CKD模型随机选取30只大鼠,按照大鼠体重相对应的阿霉素溶液(3.5mg/kg)通过尾部静脉进行注射ADR进行诱导建模,建模成功后,对大鼠进行磁共振检查、和病理切片分析。对血肌酐(SerSBE-β-CD采购um creatinine,Scr)、血尿素氮(Blood urea nitrogen,BUN)值和24h尿蛋白进行生化分析,非建模组同样通过尾部静脉注射等量的生理盐水。建模组发现Scr和BUN值均升高,上述结果验证建模成功。3.分组和BMSCs移植并检测大鼠各项实验结果将建立CKD模型成功的大鼠随机抽取16只,随机分成ADR、MSCs两组,其中ADR组是慢性肾病组(n=8),MSCs组是BMSCs治疗组(n=8)。10只非建模大鼠随机抽取8只编成第Control组,Contro组是假手术对照组(n=8)。MSCs组大鼠经肾动脉下注射BMSCs悬液。将Contro组、ADR组老鼠进行肾动脉等量的培养基注射。移植BMSCs两周后,收集Control组、ADR组、MSCs组中大鼠的血液及尿液,将大鼠处死后,选取肾组织行病理学检测,并检测Scr、BUN水平,并对肾脏组织进行ELISA分析和Western blot分析。【结果】1.BMSCs原代培养约24h后可出现贴壁生长。换液后细胞呈现类似三角形形态改变,随着细胞不断生长,形态变为不规则长条形、梭形为主的多种形态。伴随BMSCs细胞的传代培养,细胞的形态逐渐变为长梭形或扁平形。待细胞群缓慢出现融合后,BMSCs细胞密集贴壁生长于培养基中,形态类似鱼群样。将BMSCs通过成骨诱导培养基进行诱导分化培养,分化完成后用茜素红进行染色处理,并且在显微镜下观察成骨染色的效果,诱导成功后,茜素红染色呈阳性,证明BMSCs成功分化为成骨细胞。将BMSCs通过成脂诱导培养基进行诱导分化培养,分化完成后用油红O进行染色处理,并且在显微镜下观察成脂染色的效果,诱导成功后,油红O染色呈阳性,证明BMSCs成功分化为成脂细胞。2.首次注射ADR溶液2周后再次注射等量ADR溶液后建模检测。对大鼠肾脏进行磁共振检查发现:CKD组大鼠的肾皮质及外髓的信号强度均低于Sham组(P<0.01,P<0.05),以肾皮质信号减低为著,CKD组大鼠的皮髓质分界不清,Sham组大鼠的皮髓质分界清晰。大鼠肾功能检测结果显示:CKD组与Sham组相比BUN明显升高(P<0.001),Scr同样明显升高(P<0.001)。病理结果显示:CKD组与Control组相比肾小球形态萎缩、硬化,系膜增生,胶原沉积;肾小管萎缩,形态不规整,炎性细胞浸润,间质纤维化;细胞核变小、浓缩。综上,说明大鼠CKD建模成功。3.在大鼠移植BMSCs治疗一周后对三组大鼠分别进行Scr和BUN检测发现,与Control组相比,ADR组的BUN、Scr的值、肾小球损伤评分、肾小管损伤评分均明显增高(P<0.001);与ADR组相比,MSCs组BUN值下降(P<0.05),Scr值下降(P<0.01),肾小球损伤评分减低(P<0.001),肾小管损伤评分减低(P<0.01)。结果表明:BMSCs移植可以减轻CKD大鼠的肾功能损伤。4.治疗两周后,对三组大鼠肾组织切片分别进行HE染色和透射电镜观察,病理结果表明:Control组肾小球、肾小管形态正常;ADR组肾小球硬化,胶原沉积,系膜增生,肾小管形态不规整、萎缩、破烂,肾间质纤维化,有大量炎细胞浸润;MSCs组肾小球硬化及肾间质纤维化程度较ADR组减轻,肾小管萎缩程度较ADR组部分恢复。透射电镜结果显示:Control组肾小球基底膜的厚薄均匀一致,连续性完整,基底膜三层结构清晰,线粒体未见肿胀,足突排列整齐,规整覆盖在基底膜外侧,结构清楚,未见足突融合;ADR组肾小球的基底膜不规则增厚,三层结构模糊,足细胞结构排列紊乱,部分足突与基底膜相脱离,足突重度相融合,几乎看到不到清楚的裂空隔膜窗孔,足细胞的胞质明显肿胀,线粒体无明显肿胀,部分基质不均匀,嵴出现少量断裂,可见少量脱颗粒;与ADR组相比,MSCs组肾小球基底膜的增厚减轻,厚薄度相对均匀,足细胞未见明显与基底膜相脱离,足突部分轻Biomass valorization度融合,裂空隔膜窗相对明显,足细胞的胞质及线粒体稍肿胀,嵴排列相对规则,足突排列稍紊乱,无明显融合。通过透射电镜发现MSCs治疗可以改善CKD大鼠肾脏的基底膜(BM)、线粒体(M)、足突(FP)。5.ELISA检测统计分析发现:与Control组相比,ADR组肾组织中促炎因子IL-1β、IL-6浓度明显升高,且差异存在统计学意义(P<0.0001),而抑炎因子IL-10浓度下降(P<0.01);移植BMSCs后,MSCs组与ADR组相比,促炎因子IL-1β浓度下降(P<0.01),IL-6浓度下降(P<0.05),抑炎因子IL-10浓度升高(P<0.01)。ELISA结果表明:移植BMSCs可通过减轻促炎因子浓度,升高抑炎因子浓度,而抑制CKD过程中的炎症反应。6.大鼠肾组织免疫印迹结果显示:与Control组相比较,ADR组大鼠p53的蛋白表达显著上调(P<0.01),m TOR的蛋白表达显著上调(P<0.05),Bax的蛋白表达显著上调(P<0.01),Bcl-2的蛋白表达显著下调(P<0.05)。与ADR组相比较,MSCs组大鼠P53的蛋白表达显著下调(P<0.05),m TOR的蛋白表达显著调(P<0.05),Bax的蛋白表达显著下调(P<0.01),Bcl-2的蛋白表达显示上调(P<0.01)。MSCs组与Control组相比较,大鼠P53、m TOR、Bax、Bcl-2的蛋白表达改变不明显,差异无统计学意义。以上结果显示:MSCs可明显抑制阿霉素诱导的慢性肾病过程中肾细胞的凋亡,初步证实了MSCs对慢性肾病肾脏的保护机制。【结论】1.经肾动脉移植BMSCs一定程度上改善了CKD大鼠的肾功能。2.经肾动脉移植BMSCs一定程度上抑制了慢性肾病进程中的IL-1β、IL-6炎症因子,促进了抑炎因子IL-10表达。通过m TOR/p53信号通路改善了慢性肾组织的细胞凋亡进程,减轻了肾小球、肾小管损伤及肾间质纤维化。