研究背景和目的卵巢癌是女性生殖系统的常见肿瘤之一,在妇科生殖系统恶性肿瘤中致死率高居首位。由于疾病早期没有特异性,甚至有些患者没有症状,大多数患者很难在早期发现,导致在诊断时患者病情已拖延至晚期Etoposide抑制剂。卵巢癌的传统治疗手段包括:手术、放疗、化疗等,传统治疗方法早期治疗效果好,但在晚期及复发性卵巢癌中存在高耐药、易复发等问题,不能达到改善晚期患者生存率的效果,晚期卵巢癌的五年生存率非常低,低于30%。如何解决卵巢癌的早期诊断、晚期治疗耐药及复发的问题成为卵巢癌治疗成功的焦点。临床诊断和治疗现阶段面临的问题是需要积极寻找可靠的早期诊断和提高患者预后的分子标志物。免疫检查点抑制剂疗法是继手术、放疗、化疗之后的第四种肿瘤治疗方式,在临床上主要应用于经一般常规治疗失败的晚期或者复发性癌症患者;尽管免疫检查点抑制剂(Immune Checkpoint Inhibitors,ICIs)类药物在临床上已经存在成功案例,但其在妇科肿瘤的疗效欠佳,尤其在卵巢癌患者中,治疗反应率仅达7%-22%;细胞毒性T淋巴细胞抗原4(Cytotoxic T Lymphocyte-Associated Antigen-4,CTLA-4)是免疫检查点重要的组成部分,目前报道的CTLA-4用于临床的证据有限,且分子机制尚不清楚,在卵巢癌中的研究较少,其在肿瘤细胞中的作用尚需要明确研究,仍需寻求CTLA-4相关新的靶点,以提高临床疗效。综上,本研究旨在探讨CTLA-4在癌细胞中的具体表达情况及其在卵巢癌发生发展中的作用,为CTLA-4抑制剂在临床上的应用提供更丰富的理论依据。方法1.生物信息学(1)在GEPIA数据库中对CTLA-4在卵巢组织和肿瘤组织中的表达量进行分析,获得CTLA-4在卵巢癌中的表达情况。(2)通过Kaplan-Meier plotter在线数据库预测CTLA-4在卵巢癌组织中的预后价值。(3)从GEO数据库中下载卵巢癌GSE数据集,利用GEO2R工具对选取的四个微阵列数据集进行分析获得差异基因(Differentially Expressed Genes,DEGs)的数据,验证CTLA-4为卵巢癌差异基因。(4)通过韦恩图(venn)图在线工具对原始数据进行分析作图,以筛选出四个数据集共同的DEGs,取Log FC绝对值大于1,P<0.05为标准筛选差异基因。其中Log FC<0的DEGs为下调基因,Log FC>0的DEGs为上调基因。(5)利用DAVID在线数据库对差异基因进行GO和KEGG功能聚类分析。(6)通过STRING和Cytoscape在线数据库获得差异基因的PPI蛋白互作网络图,并用Cytoscape数据库的Cyto NCA、Cytohubba模块筛选卵巢癌蛋白互作网络核心靶点基因。2.组织水平(1)结合实验目的,本研究选取2019年6月至2022host genetics年6月在我院确诊为原发性上皮性卵巢癌且进行手术治疗的患者30例,另选取因卵巢交界性肿瘤患者11例,卵巢良性肿瘤患者22例,签署知情同意书后,取患者组织进行研究。(2)通过免疫组化实验检测CTLA-4在组织中的表达量,并分析各组组织之间是否存在差异性。根据留存的病例整理患者的年龄、有无淋巴结转移、肿瘤大小以及FIGO分期等临床病理特征,分析在癌组织中CTLA-4与各病理特征之间是否存在相关性。3.细胞水平(1)采用荧光定量PCR(q RT-PCR)和免疫印迹实验(Western-blot)检测不同卵巢癌细胞系(SKOV3、A2780细胞)和正常卵巢细胞(IOSE-80细胞)中CTLA-4 m RNA和蛋白selleckchem GNE-140表达水平;(2)设计CTLA-4 si RNA并转染SKOV3细胞,检测CTLA-4 si RNA敲低效率;(3)采用CCK-8细胞活性实验检测敲低CTLA-4对卵巢癌细胞增殖能力的影响。4.统计学分析所有数据统计均使用IBM SPSS Statistics 21.0软件进行统计学分析,计量资料以平均数±标准差(Mean±SD)表示,计数资料用百分率(%)表示;无序样本之间的差异比较使用t检验,计数资料比较时采用χ~2检验;P<0.05时认为差异有统计学意义。本文细胞实验涉及的实验数据均经过三次独立重复,当P<0.05时即存在差异,标记为“*”;P<0.01,标记为“**”;P<0.001,标记为“***”。并且本文中的统计图表均是通过Graph Pad Prism 9.0作图软件制作。结果1.生物信息学(1)GEPIA数据库分析发现与正常组织相比CTLA-4在人类多种肿瘤组织中高表达,在正常组织中低表达。卵巢癌组织中CTLA-4的表达显著高于正常卵巢组织,具有统计学差异;(2)K-M Plotter数据库分析发现,CTLA-4表达增高后患者无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)缩短,提示CTLA-4表达量和患者预后相关;(3)通过整合四个数据集(GSE14001、GSE105437、GSE14407、GSE18520)筛选出423个上调基因和137个下调基因,分析发现CTLA-4为卵巢癌差异上调基因;(4)对差异基因进行分析发现T细胞增殖的负调控、信号转导、参与癌症的通路、谷氨酸能突触、PI3K-Akt信号通路、人瘤病毒感染、TGF-β信号通路等参与癌症的发生发展;(5)对四个数据集的DEGs进行分析,经Cytoscape分析差异基因后对核心基因构建PPI网络,提取PPI网络中的重要模块,CTLA-4基因位于其重要模块之中,为核心靶点基因。2.组织水平(1)CTLA-4在卵巢恶性肿瘤、卵巢交界性肿瘤和卵巢良性肿瘤中的表达水平有统计学差异(P<0.05),恶性程度越高,表达水平越高;(2)CTLA-4的表达与卵巢癌的分期、淋巴结转移、年龄及肿瘤大小无显著相关性(P>0.05)。3.细胞水平(1)与正常细胞(IOSE-80)相比,在卵巢癌细胞系(SKOV3、A2780细胞)CTLA-4表达水平升高(P<0.05),在SKOV3细胞中表达含量最高;(2)在卵巢癌细胞中,CTLA-4高表达促进细胞增殖,参与卵巢癌发生发展(P<0.05)。结论1.CTLA-4在卵巢上皮性癌组织中呈现高表达;2.CTLA-4在卵巢癌细胞中呈现高表达状态,可促进细胞增殖,参与卵巢癌发生发展。