研究目的:胃癌是全球最常见的消化道恶性肿瘤之一,肿瘤的侵袭、转移和血管新生是导致患者病情迅速恶化的重要原因。近年来肿瘤微环境(tumor environment,TME)成为胃癌研究领域的热点,研究表明,TME中的肿瘤相关巨噬细胞(Tumor-associated macrophages,TAMs)在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用。巨噬细胞在人体各处局部微环境中表现出明显异质性,根据巨噬细胞表面标志物及产生的细胞因子可分为两大亚群——M1/M2型巨噬细胞。而外泌体在肿瘤微环境中发New microbes and new infections挥了衔接周围细胞与肿瘤细胞间信号传递和物质传送的重要作用。滋阴化痰方是长征医院中医科针对晚期胃癌创制的有效方药,临床可提高患者生存质量、延长生存期,前期实验研究显示滋阴化痰方对于胃癌细胞增殖和血管新生具有抑制作用,但其具体作用机制尚不清楚。本研究拟通过一系列体内外实验,探索滋阴化痰方是否能够通过调控巨噬细胞极化从而抑制胃癌血管新生,并且www.selleck.cn/products/VX-765研究外泌体是否在其中起到关键调节作用,进而揭示其可能的调控机制,为阐明有效方药治疗胃癌的科学原理提供数据支持。研究方法:首先我们建立胃癌细胞MFC(Mouse Fore-stomach Carcinoma Cell)荷瘤小鼠皮下移植瘤模型,将615小鼠分为对照组、滋阴化痰方低、中、高剂量组、巨噬细胞清除剂组和滋阴化痰方高剂量联合巨噬细胞清除剂组。1、利用免疫组化和免疫荧光实验观察滋阴化痰方对荷瘤小鼠瘤体组织微血管密度(microvessel density,MVD)的影响。2、通过细胞因子抗体芯片检测荷瘤小鼠血液免疫相关细胞因子的表达情况,并筛选其中与巨噬细胞极化相关的细胞因子。3、通过流式细胞术、免疫组化和免疫荧光实验观察滋阴化痰方对荷瘤小鼠血液、瘤体组织中M2型巨噬细胞表达的影响。通过以上动物实验观察滋阴化痰方抑制胃癌血管新生的作用是否与调控巨噬细胞有关。其次本研究采用小鼠骨髓来源巨噬细胞(Bone Marrow Derived MacroNirmatrelvir核磁phages,BMDMs)、巨噬细胞系RAW264.7作为研究对象。为探究滋阴化痰方调控巨噬细胞极化的分子机制,采用WB(Western blot)和q-PCR等方法检测滋阴化痰方作用于M2型BMDMs和RAW264.7后,STAT3、PPAR-γ、SOCS1、STAT1、JAK2和SOCS3等芯片分析及查阅文献筛选出的潜在作用靶点的表达情况。接着通过以下实验探索巨噬细胞分泌的外泌体是否参与调控胃癌细胞侵袭、迁移和血管新生。我们设立对照组、M2型BMDMs上清液组、外泌体抑制剂GW4869组、M2型BMDMs+GW4869上清液组和M2型BMDMs分泌外泌体组,运用WB、ELISA、Transwell的方法检测各组对鼠源胃癌细胞MFC和人源胃癌细胞MKN-45及细胞上清中血管新生相关因子VEGFA、VEGFC、VEGFR2和b FGF表达水平。最后为探索滋阴化痰方是否调控巨噬细胞分泌的外泌体抑制胃癌血管新生,我们将滋阴化痰方作用于M2型BMDMs后提取上清液中的外泌体。运用Transwell实验观察其对胃癌细胞迁移和侵袭的影响。通过HUVECs(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,人脐静脉内皮细胞)管腔形成实验,观察其与胃癌细胞共培养后提取的细胞上清对HUVECs形成管腔能力的影响。运用WB、ELISA和q-PCR的方法观察其对胃癌细胞分泌VEGFA、VEGFC、VEGFR2和b FGF及蛋白、m RNA表达水平的影响。运用WB的方法检测滋阴化痰方作用于M2型BMDMs所提取外泌体作用胃癌细胞后,VEGF基因转录相关的NF-κB信号通路上p-65、IκBα、My D88等相关蛋白的表达。结果:首先免疫组化、免疫荧光实验结果表明,滋阴化痰方组荷瘤小鼠瘤体微血管密度下降,且呈剂量依赖性。细胞因子抗体芯片分析表明,与对照组相比,滋阴化痰方组荷瘤小鼠外周血中IL-6、TNF-α、IL-1β等与M1型巨噬细胞相关的促炎因子表达水平显著上升,TGF-β1、IL-10等与M2型巨噬细胞相关的抗炎因子表达水平显著下降。流式细胞术、免疫组化、免疫荧光实验显示,滋阴化痰方降低了荷瘤小鼠瘤体组织中M0型巨噬细胞标志物F4/80和M2型巨噬细胞标志物CD206的表达水平。体内实验表明滋阴化痰方抑制胃癌血管新生的作用可能与调控巨噬细胞有关。其次WB和q-PCR的结果显示,与对照组相比,滋阴化痰方组M2型巨噬细胞中的STAT1、JAK2和SOCS3的表达水平升高,而STAT3、PPAR-γ和SOCS1的表达受到了抑制,初步探讨了滋阴化痰方调控巨噬细胞极化的分子机制。接着WB、ELISA和Transwell的结果显示,M2型BMDMs的细胞上清可上调胃癌细胞中VEGFA、VEGFC、VEGFR2和b FGF的表达,其中M2型BMDMs细胞上清分泌的外泌体起主要促进作用。最后Transwell实验结果表明,滋阴化痰方作用于M2型BMDMs后提取的外泌体可抑制胃癌MFC和MKN-45细胞的迁移和侵袭,且呈剂量依赖性。HUVECs管腔形成实验证明,其可明显抑制HUVECs的管腔形成能力。WB、ELISA和q-PCR的实验结果表明,滋阴化痰方能降低MFC和MKN-45细胞及细胞上清中VEGFA、VEGFC、VEGFR2和b FGF表达。WB结果显示,滋阴化痰方干预M2型BMDMs提取的外泌体能抑制胃癌细胞MFC和MKN-45中p-65、My D88的表达,上调IκBα的表达。证实了外泌体是滋阴化痰方调控巨噬细胞极化抑制胃癌血管新生的关键调控者。结论:1.巨噬细胞向M2极化在胃癌发生发展中发挥重要作用,体内外实验证实滋阴化痰方可抑制巨噬细胞向M2极化,其机制可能与抑制SOCS1/STAT3/PPAR-γ通路,激活STAT1/JAK2/SOCS3通路有关。2.巨噬细胞分泌的外泌体可促进胃癌细胞的迁移、转移及血管新生,滋阴化痰方可通过抑制巨噬细胞向M2极化发挥其抗胃癌侵袭、转移及血管新生作用,其作用机制与巨噬细胞分泌的外泌体有关。