研究目的:由于全球人口老龄化、肥胖、不健康的饮食习惯以及久坐生活方式的发展,糖尿病及其并发症迅速发展。据国际糖尿病联合会(International Diabetes Federation,IDF)估计,2021年全球有5.37亿成年人(20-79岁)患有糖尿病,预计到2030年,这一数字将上升到6.43亿,到2045年将上升到7.83亿。在所有糖尿病中,2型糖尿病(Type 2 diabetes,T2DM)患者占90%以上,T2DM是一种慢性代谢性疾病,它的主要特征是由胰岛β细胞功能障碍和胰岛素抵抗(Insulin resistance,IR)引起的胰岛素相对缺乏。胰岛素的主要作用是促进骨骼肌、肝脏和脂肪等组织中营养的吸收和储存,IR主要表现为骨骼肌、肝脏和脂肪等组织对葡萄糖的摄取受损,从而破坏全身葡萄糖稳态,导致高血糖和高脂血症,进而导致了许多如微血管疾病(糖尿病肾病,糖尿病视网膜病变和糖尿病足)和大血管疾病(中风,心脏病)等T2DM相关的并发症,这些并发症给医疗保健系统带来了巨大的压力。Sestrin2是哺乳动物中Sestrins蛋白质家族Brain-gut-microbiota axis的成员之一,曾被命名为Hi95,它在长期缺氧、DNA损伤或氧化应激状态下被激活,对细胞具有保护作用。Sestrin2主要受肿瘤抑制因子P53调控,p53是一种应激激活的转录因子,介导Sestrin2激活AMPK、抑制mTORC1,从而抑制细胞增殖或诱导细胞死亡。此外,Sestrin2还参与各种缺氧相关疾病,如脑缺氧疾病、心肌缺氧疾病、缺氧相关呼吸系统疾病和糖尿病等。研究发现,Sestrin2与2型糖尿病密切相关,Sestrin2敲除后,肥胖诱导的小鼠葡萄糖不耐受、胰岛素抵抗和炎症反应加剧。Sestrin2过表达可通过增加胰岛素敏感性、抑制氧化应激应激、促进线粒体自噬、抑制炎症反应等多条通路,参与调控T2DM的发病进程。研究表明,Sestrin2水平与糖尿病患者的冠心病、糖尿病肾病高度相关,在糖尿病冠心病或糖尿病肾病患者血清中,Sestrin2水平显着降低,血清Sestrin2水平低与糖尿病冠心病风险增加有关。然而,另有研究表明,在喂食高脂肪饮食的大鼠肝脏中Sestrin2的表达上调,在代谢综合征受试者特别是在2型糖尿病患者中Sestrin2水平呈增加的趋势,且Sestrin2浓度与胰岛素抵抗呈显著正相关。因此,Sestrin2参与调控T2DM的机制仍存在争议。骨骼肌是人类负责维持正常葡萄糖稳态的最大胰岛素反应器官,骨骼肌代谢功能障碍会导致胰岛素抵抗,骨骼肌胰岛素抵抗被认为是T2DM发病机制的主要驱动因素,讨论骨骼肌胰岛素抵抗对T2DM的防治意义重大。因此本研究以C2C12肌管为实验对象,用棕榈酸(Palmitic acid,PA)诱导C2C12肌管胰岛素抵抗模型,通过免疫荧光、油红O染色、Werstern blot,观察Sestrin2的蛋白表达情况,从而探究Sestrin2在骨骼肌胰岛素抵抗发病机制中的作用,以期为T2DM的靶向治疗提供更多的理论据。研究方法:(1)细胞传代培养当C2C12小鼠成肌细胞生长至80%-90%融合时进行传代,弃掉废液,加入1ml胰酶消化2min左右,待细胞收缩变圆时加入3ml培养基终止消化,用吸管将贴壁细胞吹打下来,并转入15ml离心管内,1000rpm,离心时间5min,弃上清后用1-2ml含10%胎牛血清和1%青链霉素的完全培养液重悬细胞,摇晃均匀,以1:3接种至提前加入适当完全培养基的培养皿以扩大培养。(2)诱导分化C2CSB431542作用12小鼠成肌细胞细胞生长至70-80%融合时,以3*105每孔的密度接种到六孔板上,每孔加2ml培养基,置于37℃,5%C点击此处O2细胞培养孵育箱中孵育,培养24h,使贴壁细胞形成单层细胞。当融合度达到80%左右时将培养液换为含有2%马血清和1%青链霉素的高糖DMEM分化液,每两天换一次液,4-7天形成大量肌管后,用于后续实验。(3)棕榈酸诱导IR模型分化4-7天后,实验组用0.6mM棕榈酸孵育C2C12肌管细胞16h,制造肌管细胞胰岛素抵抗模型,用2%BSA的高糖DMEM培养基作为对照培养。(4)实验分组NC组为正常对照组,PA组为胰岛素抵抗模型组(5)实验方法通过葡萄糖含量检测试剂盒测定上清液葡萄糖摄取量、油红O染色测定脂质沉积、ROS含量检测试剂盒测定氧化应激反应、Western blot(WB)测定IRS-1和GLUT4蛋白表达,验证胰岛素抵抗造模是否成功。用Western blot测定Sestrin2蛋白的表达情况。(6)数据分析所有实验结果用均数±标准差(x±SD)表示,使用SPSS 22.0软件对实验数据进行分析处理,主要采用的统计学方法为组内比较使用配对样本T检验,组间样本比较使用独立样本T检验,以P<0.05表示差异具有统计学意义,P<0.01表示差异极具有统计学意义,利用ImageJ软件进行WB蛋白条带进行分析。研究结果:2%马血清诱导肌管形成(如图1所示)(1)与NC组相比,PA组的脂质沉积明显(如图2所示);葡萄糖摄取量显著下降((P=0.034<0.05);IRS-1(P=0.004<0.01)蛋白含量和GLUT4(P=0.016<0.05)蛋白含量显著下降;说明棕榈酸诱导的C2C12肌管胰岛素抵抗造模成功。(2)NC组相比,PA组的ROS明显升高,出现氧化应激反应(如图3所示);(5)与对照组相比,实验组Sestrin2蛋白的表达显著上升(P=0.019<0.05)。研究结论:在骨骼肌胰岛素抵抗个体中,胰岛素信号通路受损,ROS明显升高,Sestrin2基因表达显著上调。Sestrin2水平的增加可能源于一种代偿机制,棕榈酸诱导的氧化应激反应诱导Sestrin2表达上调,从而代偿性保护机体免受侵害。未来展望:本研究存在一定局限性,目前的数据只能单方面证明骨骼肌胰岛素抵抗可能会导致Sestrin2表达上升,但不能明确它们两者因果关系,因此下一步的研究可以通过沉默Sestrin2来确认Sestrin2是否会导致骨骼肌胰岛素抵抗,或通过过表达Sestrin2来确认Sestrin2是否具有改善骨骼肌胰岛素抵抗的潜力。另外,有研究表明,运动后骨骼肌中Sestrin2表达显著增加,但运动介导Sestrin2的上调是否足以改善骨骼肌胰岛素抵抗仍不明确。因此未来有必要进一步探究运动是否以及如何通过介导Sestrin2调控骨骼肌胰岛素抵抗,从而靶向治疗T2DM。