第一部分阿霉素通过诱导血管损伤进而引起血小板活化以及血栓形成背景与目的:阿霉素是临床实践中治疗恶性血液肿瘤及实体瘤的最经典化疗药物之一,但是其临床应用却受到心脏毒性等副作用的限制。阿霉素药物引起的心脏毒性已成为肿瘤患者化疗后死亡风险增加的重要因素之一。既往研究证实阿霉素可增加约20%心肌梗死的发病率。一项小型临床前瞻性研究发现,接受阿霉素治疗的肿瘤患者中,与基线水平相比,Ⅰ期化疗后的血小板聚集显著增加。该结果提示我们阿霉素可能会导致血小板异常活化。但是亦有体外研究表明,阿霉素刺激对血小板聚集、黏附或者分泌等功能无任何影响。血小板的活化依赖于内皮功能,因此离体实验存在局限性。在体环境中,阿霉素是否可以引起血小板激活进而促进血栓形成及其具体机制尚未完全阐明。本研究旨在探讨阿霉素对血小板功能的影响及其相关的机制,并在此基础上评估抗血小板药物的治疗效果。方法:我们进行了两批动物实验,第一批,C57BL/6J雌性小鼠分为2组:(1)阿霉素处理组:阿霉素粉末以二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解成为100mg/ml的储存液,注射时以生理盐水稀释为5mg/ml(50μl储存液溶解至10ml生理盐水中,DMSO含量为0.5%),鼠尾静脉注射阿霉素,剂量5mg/kg/周,共4周,累积剂量为20mg/kg;(2)对照组:鼠尾静脉注射等量含0.5%DMSO的生理盐水。各组小鼠分别取血、分离并纯化血小板后,完成以下实验检测:(1)全自动血细胞分析仪测定各组小鼠血液中血小板的数量、平均血小板体积及血小板分布宽度;(2)流式细胞仪分析检测血小板表面黏附受体表达;(3)透射电镜观察血小板内部颗粒数量变化;(4)检测静息状态或激动剂诱导下血小板的聚集与脱颗粒情况;(5)检测各组血小板对纤维蛋白原及内皮细胞的黏附能力;(6)检测各组小鼠尾部出血时间以及胶原刺激下体外血栓形成情况。第二批观察抗血小板药物氯吡格雷是否抑制阿霉素引起的血小板活化。C57BL/6J雌性小鼠分为4组:(1)含0.5%DMSO的生理盐水鼠尾静脉注射+生理盐水灌胃;(2)含0.5%DMSO的生理盐水鼠尾静脉注射+氯吡格雷粉末溶于生理盐水后灌胃(氯吡格雷剂量:第一天15mg/kg,后续为5mg/kg/天,直至取材结束);(3)阿霉素静脉注射+生理盐水灌胃;(4)阿霉素静脉注射+氯吡格雷灌胃。重复以上(1)-(6)实验,并检测各组小鼠血管功能变化、血管组织中血小板血管浸润情况以及血管组织的氧化应激水平。结果:我们发现:(1)阿霉素处理后小鼠血小板计数、平均血小板体积、血小板分布宽度、表面重要受体(GPIbα,GPVI,αⅡb)的表达以及内部颗粒(α颗粒以及致密颗粒)的数量均无明显变化;(2)阿霉素增强激动剂诱导的血小板聚集,脱颗粒及释放;(3)阿霉素增强血小板对纤维蛋白原以及内皮细胞的黏附;(4)阿霉素诱导的血小板活化为内皮依赖型;(5)阿霉素活化的血小板可加速体外血栓形成;(6)氯吡格雷治疗抑制了阿霉素诱导的血小板活化及血栓形成,同时抑制血小板的血管浸润,降低血管活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平。结论:综上所述,本研究表明小鼠尾静脉注射阿霉素可导致血小板活性显著增强,进一步促进血栓形成以及血管损伤;而氯吡格雷治疗可以有效抑制阿霉素引起的血小板异常活化。因此,在合适的时机进行抗血小板药物治疗可以显著降低在肿瘤化疗时血栓形成的风险。第二部分一种用于监测肿瘤以及化疗相关血小板活化的微流控装置背景与目的:大量临床研究表明肿瘤患者血栓形成的风险增加。肿瘤自身分泌的炎症介质和促凝因子等可促进血栓形成,而化疗药物的使用可导致该情况进一步恶化。既往实验发现在纯化的血小板中加入阿霉素刺激并不能导致血小板的活化,该结果证实化疗药物对血小板无直接影响。我们之前的研究亦表明,内皮细胞损伤是化疗药物阿霉素诱导血小板活化的主要机制。血小板极易获得,如果能在化疗药物或者靶向药物应用之前对患者血小板进行评估,就可以最大程度降低肿瘤患者的血栓发生,减少严重的并发症和死亡。但传统的血小板活性检测方法,包括血小板聚集和流式细胞术等,仅关注血小板本身,并不涵盖内皮细胞、肿瘤细胞以及血流速等重要因素,因此传统的方式并不能作为评估肿瘤患者发生血栓风险的理想方法。因此,我们有必要开发一个包含所有潜在的风险因素的血Gefitinib-based PROTAC 3分子式小板活性检测系统。方法:在本研究中,我们建立了一种微流控体系,由药物浓度梯度芯片、肿瘤细胞培养小室和微血管模型三部分组成。将含有0μmol/L和4.0μmol/L浓度阿霉素的培养基分别注入浓度梯度芯片的两个入口中,在出口稳定形成0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0HIV-1 infection、3.5和4.0μmol/L的9种依次递增GSKJ4纯度阿霉素浓度梯度。不同浓度的阿霉素流经种植有MCF-7细胞的肿瘤芯片以及微血管模型,通过细胞计数、细胞骨架观察、内皮细胞细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)免疫荧光染色、培养基中内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)与内皮素-1(endothelin-1,ET-1)水平检测等方法评价不同浓度阿霉素单独以及与MCF-7细胞联合作用后的内皮细胞损伤程度。将预染色的血小板灌注至微血管模型中,进一步检测血小板-内皮细胞黏附能力。结果:经过上述实验,我们有如下几点重要且独创性的发现:(1)MCF-7乳腺癌细胞释放的细胞因子对内皮细胞和血小板均产生细胞毒性作用,表现为内皮细胞结构紊乱、损伤标志物表达增加以及血小板-内皮细胞黏附增强;(2)进一步证实阿霉素诱导的血小板活化是通过其损伤内皮细胞而介导的;(3)低浓度阿霉素(0-2.0μmol/L)可引起血小板活化,而高浓度的阿霉素(2.0-4.0μmol/L)则会导致血小板死亡。结论:我们首次报道了一种可用于监测接受化疗的肿瘤患者血小板活性的微流控芯片装置,其中包括药物浓度梯度生成单元,肿瘤细胞培养单元,以及覆盖有内皮细胞的三维微血管模型三部分。肿瘤患者的血小板提纯后可灌注至三维微血管模型中。我们可以通过该芯片,以血小板-内皮细胞黏附强度作为血小板活化的检测指标,为评估肿瘤患者化疗前以及监测肿瘤患者化疗中血小板异常活化程度提供了一种简单、快速、且准确的检测方法。该方法为是否对肿瘤患者进行抗血小板干预、并且何时进行干预提供了充分的依据。