研究背景糖尿病心肌病(DCM)是指糖尿病患者在不合并其他心血管疾病的情况下出现的心脏结构或功能异常。作为糖尿病的重要心血管并发症之一,DCM在糖尿病人群中的发病率为11.7%-67.0%,5年心力衰竭(HF)的发生率达到8.4%-12.8%,较高的发病率及致HF发生率使DCM受到广泛的重视,有关DCM的基础及临床研究也不断推进。已经证实包括氧化应激水平增加、胰岛素抵抗、线粒体功能障碍、钙离子稳态异常等多种病理因素参与了 DCM的发生发展,同时新的治疗理念及新型降糖药也不断应用于临床,但尽管如此,在采用严格的降糖治疗及规范的抗HF治疗之后仍有约50%的糖尿病患者出现不同程度的心脏功能障碍。因此,亟需继续深入探索DCM的发病机制,寻找新的潜在的DCM治疗策略。器官(组织)与器官(组织)之间可通过一些分泌蛋白或内分泌因子产生相互作用(Crosstalk),对维持机体稳态意义重大。肝脏合成并分泌的“肝脏因子”同样对全身代谢有重要影响。同时,肝脏与心脏之间的联系非常紧密,心脏疾病如HF可导致慢性淤血性肝病及急性心源性肝损伤,同样,肝脏疾病不仅可以使原有的心脏疾病加重,还可导致HF、肝硬化性心肌病等。而肝脏疾病状态下特定“肝脏因子”的表达变化以及“肝脏因子”能否对心脏产生作用鲜有报道。因此,寻找肝脏与心脏之间这种内在分子联系,可能为DCM的治疗开辟一个新的方向。Ⅲ型纤维连接蛋白结构域包含蛋白4(FNDC4),因在肝脏中高表达而被称为“肝脏因子”,其与“肌肉因子”FNDC5高度同源,二者在细胞内均能发生剪接并BAY 73-4506研究购买被分泌至胞外发挥作用。现有研究报道,FNDC4具有改善胰岛素抵抗、促进脂肪褐变、减轻炎症等作用。同时,我们课题组前期研究发现,DCM小鼠心肌中FNDC5/irisin水平降低,恢复FNDC5/irisin可显著改善心脏舒张功能;Irisin可改善2型糖尿病(T2DM)小鼠血管内皮细胞功能。而DCM状态下FNDC4水平的变化及肝脏来源的FNDC4是否能对心脏功能产生影响,同时,改变FNDC4水平是否影响DCM患者心脏功能,这些问题我们尚不清楚。研究目的(1)观察DCM小鼠体内FNDC4水平的变化;(2)明确FNDC4对DCM小鼠心脏的作用;(3)阐明FNDC4对DCM心脏作用的分子机制。研究方法第一部分:观察DCM小鼠和T2DM患者FNDC4水平的变化及静脉注射过表达FNDC4的重组腺相关病毒对DCM小鼠心脏结构及功能的影响(1)基于db/db小鼠构建DCM小鼠模型,采用Western blotting及RT-qPCR等方法检测小鼠肝脏、心脏、血浆中FNDC4的变化;(2)获取健康志愿者和T2DM患者血浆,采用Western blotting检测血浆FNDC4的水平;(3)构建rAAV9-Fndc4-3Flag及对照病毒rAAV9-con,通过静脉注射使4周龄小鼠全身过表达FNDC4,8周龄验证各组过表达效率,记录16周龄小鼠体重及空腹血糖,采用马松三色染色及天狼星红染色评估各组小鼠心肌组织纤维化、WGA染色评估小鼠心肌肥厚、TUNEL染色检测小鼠心肌细胞凋亡、小动物超声系统及血流动力学系统评估小鼠心脏舒张及收缩功能,观察FNDC4对DCM小鼠心脏结构及功能的影响。第二部分:体外验证FNDC4是否具有直接心肌细胞保护作用(1)采用高糖/高脂培养基(HG/HF)体外模拟T2DM状态,孵育大鼠乳鼠心室心肌细胞(NRVMs),同时给予FNDC4重组蛋白处理,采用Western blotting、流式细胞术、TUNEL染色、细胞活力实验等手段检测各组细胞的凋亡/损伤情况,观察FNDC4是否具有直接心肌细胞保护作用;(2)构建 Adenovirus-Fndc4 及 Adenovirus-con,通过给 AML12 细胞转染 Adenovirus-Fndc4使其过表达FNDC4,并收集细胞上清,采用Western blotting检测上清中FNDC4的水平,观察AML12是否能够分泌FNDC4至胞外;用收集的AML12细胞上清及棕榈酸钠(3 00μmol/L)孵育NRVMs,采用Western blotting检测各组细胞cleaved caspase3的表达,观察过表达FNDC4的AML12细胞上清是否同样具有心肌细胞保护作用。第三部分:探讨FNDC4发挥心肌保护作用的分子机制(1)用FNDC4重组蛋白孵育NRVMs,并进行转录组测序,然后基于差异表达基因进行Wikipathway富集分析,筛选出介导FNDC4心肌保护作用可能的候选分子Nrf2,并采用RT-qPCR及Western blotting对候选分子进行筛选验证;(2)用FNDC4重组蛋白孵育NRVMs,分离细胞核及细胞浆蛋白进行Western blotting分别检测核、浆Nrf2的变化,同时采用免疫荧光染色观察Nrf2的核转位情况;通过构建si-Nrf2抑制Nrf2的表达,观察可能的下游分子(HO-1及NQO1)的变化,明确Nrf2对下游分子的影响;(3)采用U0126抑制ERK1/2的激活,观察Nrf2、HO-1及NQO1的变化,明确ERK1/2的激活对Nrf2的影响;(4)构建si-Gpr116,抑制NRVMs的GPR116的表达之后观察ERK1/2的磷酸化水平、cleaved caspase3、HO-1及NQO1的表达水平,明确FNDC4是否通过GPR116激活ERK1/2,进而激活Nrf2依赖的心肌保护作用。第四部分:阐明FNDC4是否具有内皮细胞保护作用并验证其机制(1)采用免疫荧光染色检测DCM小鼠心肌组织CD31的表达;(2)构建si-Gpr116抑制HUVEC GPR116的表达,以FNDC4重组蛋白孵育HG/HF处理的 HUVEC,采用 Western blotting检测 cleaved caspase3、HO-1 及 NQO1 的表达水平,评估FNDC4是否对HUVEC具有保护作用。研究结果(1)相比db/+对照组小鼠,DCM小鼠肝脏组织、心肌组织、血浆中FNDC4水平均显著下降;T2DM患者血浆中FNDC4水平降低。静脉注射rAAV9-Fndc4-3Flag 4周后可使小鼠肝脏、心脏成功过表达FNDC4,同时血浆中FNDC4水平也显著增高;过表达FNDC4不影响小鼠体重及空腹血糖,但可显著改善DCM小鼠心肌肥厚及纤维化、减少心肌细胞凋亡、改善心脏舒张功能,同时不影响小鼠心脏的收缩功能。(2)离体状态下,FNDC4重组蛋白显著降低HG/HF孵育的NRVMs损伤程度及cleaved caspase3的表达,减少HG/HF孵育的NRVMs凋亡细胞的比例。(3)FNDC4重组蛋白通过GPR116激活ERK1/2,促进Nrf2发生核转位,进而上调抗氧化蛋白HO-1及NQO1的表达,减轻HG/HF诱导的心肌细胞凋亡。(4)FNDC4重组蛋白可通过上调HUVEC中HO-1及NQO1表达,降低HG/HF孵育的HUVEC中cleaved caspase3的表达水平。研究结论我们首次发现并证实了肝脏因子FNDC4可减轻DCM小鼠心肌肥厚和纤维化,减少心肌组织中心肌细胞和内皮细胞凋亡,改善心脏舒张功能,并进一步验证FNselleck化学DC4通过intravenous immunoglobulinGPR116/ERK1/2/Nrf2/HO-1&NQO1通路发挥上述心脏保护作用,从而为DCM的治疗提供了 一个潜在干预靶点。