研究背景与目的电针对炎症性疾病具有较好的临床疗效,但其机制仍不明确。自主神经抗炎机制参与电针抗炎效应,解码电针腧穴调控交感、副交感神经系统抗炎途径,对于优化临床选穴、扩展针灸适宜症范围具有重要意义。交感-肾上腺轴属于自主神经抗炎机制中的系统性抗炎途径。我们前期观察到电针对内脏功能具有节段性调节规律,那么电针肾上腺同节段穴位,是否能够通过调控交感-肾上腺轴发挥系统性抗炎效应,目前还不明确,基于此,本研究以大鼠为研究对象,观察:1)电针驱动交感-肾上腺轴的穴位分布及刺激参数规律;2)在脓毒症模型中,探讨电针驱动交感-肾上腺轴抗炎途径的神经生物学机制。方法本研究以正常SD大鼠为实验对象,分为以下三个部分:实验一体表电刺激调控肾上腺交感神经活动的节段性规律及效应机制1.采用在体电生理技术记录体表电刺激诱发肾上腺交感神经活动的早、晚反射,通过给予大鼠体表不同强度(0.5–5.5 m A)、不同频率(1–1000 Hz)电刺激,观察体表刺激调控肾上腺交感神经活动的节段、强度及频率规律,计算相应的EC50值;2.在记录到不同节段诱发的早、晚反射后,对大鼠进行脊髓化(切断T5脊髓)处理,以验证不同节段体表刺激诱发肾上腺交感神经反射的脊髓上中枢机制;3.大鼠分为对照组、EA T9组和EA L4组,以T9-EC50值作为刺激强度,给予两组大鼠T9和L4皮节电针刺激连续3天。刺激结束后,用质谱检测法测量大鼠外周血中肾上腺髓质儿茶酚胺多巴胺(Dopamine,DA)、肾上腺素(Epinephrine,E)、去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)和糖皮质激素(皮质酮、皮质醇)及其代谢产物的水平,进一步明确T9皮节电刺激对肾上helicopter emergency medical service腺髓质及皮质激素的影响。实验二脓毒症模型下电针同节段与远节段的抗炎效应1.电针T9或L4皮节对LPS引起的脓毒症模型7天内治疗作用,大鼠随机分为对照组、模型组、模型+EA T9组、模型+EA L4组。造模后连续电针3天,进行模型评分及7天生存率记录;采用质谱检测法测量大鼠外周血中DA、E、NE水平;2.电针T9或L4皮节对LPS引起的脓毒症模型6小时内治疗作PF-03084014采购用,大鼠随机分为模型组、模型+EA T9组、模型+EA L4组,造模后立即电针T9或L4皮节并在0、1、2、4、6小时时间点经动脉取血,采用ELISA方法检测血清IL-6、IL-1β、IL-10与TNF-α含量。实验三电针T9皮节激活交感-肾上腺轴治疗脓毒症的神经-免疫机制1.电针T9皮节发挥抗炎效应的神经递质NE来源,大鼠随机分为对照组、模型组、模型+EA T9组、模型+EA双侧肾上腺切除(adrenalectomy,ADX)组、模型+EA 6-OHDA组,腹腔注射6-OHDA只消除外周儿茶酚胺作用而不影响交感肾上腺髓质神经支配,切除双侧肾上腺消除肾上腺髓质分泌儿茶酚胺,对照组腹腔注射等体积生理盐水。造模后电针干预3天,观察7天内生存率,及另一批造模后4小时经动脉取血,采用ELISA方法检测血清IL-6、IL-1β、IL-10与TNF-α含量。2.NE可能作用于脾脏巨噬细胞β_2受体,诱导M2巨噬细胞极化,大鼠随机分为对照组、模型组、模型+EA T9组、模型+EA+Clo-Lip组、模型+EA ICI188,551组,两种药物分别清除全身巨噬细胞或全身β_2受体,造模后电针T9或L4皮节,观察生存率与生存指标,另一批造模后12小时后取脾脏进行流式实验,观察脾脏中巨噬细胞M1型(促炎)与M2型(抗炎)比例,探究交感-肾上腺轴介导电针T9皮节治疗脓毒症可能的机制。结果实验一体表电刺激调控肾上腺交感神经活动的节段性规律及效应机制1.刺激体表不同节段均能引起肾上腺交感神经反射,以同节段T9或T10皮节最优。以T9皮节为例,早反射阈值最小为1.30±0.10 m A、早反射潜伏期最短为19.79±0.61 ms、早反射持续时间最长为29.52±1.83 ms,晚反射阈值最小为2.43±0.22 m A、晚反射潜伏期最短为125.80±2.86 ms、晚反射持续时间最长为75.74±7.24 ms);刺激T9皮节兴奋肾上腺交感神经强度EC50值为2.97 m A,频率EC50值为5.25 Hz,T9节段抑制肾上腺交感神经频率IC50值为62.94 Hz,刺激诱发肾上腺交感反射有脊髓节段性与上位中枢两种成分,与此同时,同节段T9皮节引发的节段性早反射放电频率增加(P<0.05),提示同节段A类引发的交感神经活动是受上位中枢抑制;2.两组大鼠T9和L4皮节电针刺激连续3天,较EA+L4组,EA刺激同节段T9皮节可以显著提高外周血中儿茶酚胺浓度,其效应优于远节段皮节刺激,且两者电针刺激较对照组对糖皮质激素并无影响(P>0.05)。实验二脓毒症模型下电针同节段与远节段的抗炎效应1.在LPS诱导的脓毒症模型大鼠上,较模型组,电针T9皮节可以显著提高脓毒症大鼠生存率(P<0.05),改善大鼠病理评分(P<0.05),大鼠外周血中NE显著增加(P<0.05),电针T9皮节在LPS模型大鼠抗炎作用可能与NE有关;2.在脓毒症6小时内,较模型组,电针T9皮节显著降低外周血中的促炎因子IL-6与IL-1β,提高抗炎因子IL-10(IL-6:P<0.001;IL-1β:P<0.05,2-6 h;IL-10:P<0.001,2h)。实验三电针T9皮节激活交感-肾上腺轴治疗脓毒症的神经-免疫机制1.腹腔注射6-OHDA切除交感神经末梢后,电针T9皮节仍能提高大鼠生存率(P<0.05),较control组大鼠生存率没有差异(P<0.05)。但是ADX消除肾上腺髓质释放儿茶酚胺后,较模型组大鼠生存率显著降低(P<0.05),较EA组大鼠生存率显著降低(P<0.001),且EA+ADX组引起血清促炎因子在造模后第4小时IL-6、IL-1β和TNF-α水平显著升高(IL-6:P<0.05;Il-1β:P<0.05;TNF-α:P<0.001),表明电针T9皮节与交感-肾上腺轴密切相关;2.注射巨噬细胞消除剂Clodronate Liposomes(Clo-Lip)清除全身巨噬细胞后,脓毒症大鼠生存率增加到83.33%,较EA组相比,EA+Clo-Lip组促炎因子IL-6含量显著降低(P<0.001);用流式细胞术对大鼠脾脏中的巨噬细胞及其M1(促炎)、M2(抗炎)亚型比例进行检测,结果显示:与对照组相比,LPS进行脓毒症造模后,模型组大鼠巨噬细胞的数量及其M1、M2亚型比例均显著升高(巨噬细胞总数:P<0.05;M1:P<0.01;M2:P<0.001),提示脓毒症导致巨噬细胞增殖;与模型组相比,EA组巨噬细胞数量无显著变化(P>0.05),但促炎型M1巨噬细胞的比例显著降低(P<0.01),抗炎型M2巨噬细胞比例显著增高(P<0.01),提示电针T9皮节介导的抗炎效应与调节巨噬细胞极化有关,即降低促炎型M1、增加抗炎型M2巨噬细胞亚型比例。注射ICI188,551阻断肾上腺素能β_2受体后,脓毒症大鼠生存率与模型组无差异,较EA组相比,EA+ICI188,551组促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α含量显著增高(P<0.001)。以上结果表明电针T9皮节的抗炎效应主要与交感-肾上腺轴分泌高浓度NE相关,NE可以结合巨噬细胞β_2受体,使巨噬细胞极化为M2分泌抗炎因子IL-10,降低IL-6、IL-1β与TNF-α促炎因子含量,提高动物生存率BMS-354825试剂。结论1.电刺激体表T3-T12皮节均能诱发肾上腺交感神经反射,以肾上腺相同节段T9皮节最优,其机制包含脊髓节段性与上位中枢两种成分;2.3 m A、20 Hz是电针T9皮节天枢穴激活交感-肾上腺轴的最佳刺激参数,可以显著增加外周血中NE与E的水平;3.采用3 m A,20 Hz电针T9皮节可以显著改善脓毒症模型大鼠生存率及模型评分,降低促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平,增加抗炎因子IL-10水平。其机制与电针T9皮节激活交感-肾上腺轴使其释放NE,作用于巨噬细胞上的肾上腺素能β_2受体,使巨噬细胞极化为M2型,分泌IL-10抗炎因子有关。