【目的】1.探明云南不明原因猝死地区隐花青鹅膏的心肌毒性,明确其是否应该被禁止食用,并且初步探索其中机制,为此类猝死的防治提供依据。2.探明目前在云南多地被食用而我们前期实验揭示具有低毒性的隐花青鹅膏,能否与NUP155~(V402M)基因突变共同作用导致心肌细胞损伤,并初步探索其作用机制。【方法】1.隐花青鹅膏的采集、鉴定、前处理及HL-1细胞毒性实验。协同地方疾控中心及当地村民在YNSUD发生地采集隐花青鹅膏,通过形态学及基因测序方法鉴定所采集野生菌的种属,以所测野生菌DNA序列构建物种发育树,然后低温干燥隐花青鹅膏、再研磨、过筛制备隐花青鹅膏干粉,用超声波萃取法从隐花青鹅膏干粉中提取浸膏以干预HL-1细胞。将已收集到的9个YNSUD发生地采集的隐花青鹅膏制成有机冷提浸膏,用浸膏干预HL-1细胞,再通过CCK8毒性实验检测并比较不同产地隐花青鹅膏的心肌毒性,同时筛选出对HL-1心肌细胞毒性相对较强的隐花青鹅膏,然后用筛选出的隐花青鹅膏浸膏干预HL-1并借助流式细胞术进行细胞凋亡检测,同时还利用免疫荧光技术和蛋白质印迹技术对NUP155及HSP70蛋白的表达位置和表达量进行检测。2.隐花青鹅膏对小鼠的急性毒性实验。选取对HL-1细胞毒性较强的几种隐花青鹅膏干粉,参照成年人单餐野生菌食用量及通过小鼠与人体重、oral anticancer medication体表面积计算出的灌胃比例确定小鼠隐花青鹅膏灌胃量,以最大灌胃剂量法计算单次灌胃剂量,然后用生理盐水混匀隐花青鹅膏干粉后对小鼠进行灌胃。在灌胃隐花青鹅膏后的不同时间点,使用RM6240多道生理信号采集处理系统检测各组小鼠心电图并统计分析心电图P波振幅、R波振幅、PR间期、QRS间期,取小鼠血液用ELISA法检测血清心肌肌钙蛋白(c Tn I、c Tn T)水平,并取小鼠心脏,称量计算脏器指数,最后制作心肌切片用于HE染色观察和透射电镜观察。3.隐花青鹅膏浸膏获悉更多对NUP155~(V402M)突变HL-1的毒性作用。通过慢病毒构建NUP155~(V402M)突变和NUP155~(WT)野生型HL-1细胞株,并用绿色荧光标记蛋白、嘌呤霉素抗性和目标蛋白NUP155的检测以鉴定突变稳转株的成功构建,同时设置未感染的HL-1细胞为对照,在用隐花青鹅膏浸膏干预后,联合CCK8法和流式细胞术检测心肌细胞活性及凋亡情况,通过免疫荧光法及蛋白质印迹技术对HL-1细胞中的NUP155蛋白和HSP70蛋白的表达位置和表达量进行检测。【结果】1.YNSUD当地村民仅根据野生菌外在形态特征对隐花青鹅膏进行采集会出现误采的情况,本次实验中误采的野生菌包括袁氏鹅膏、假褐云斑鹅膏及暗盖淡鳞鹅膏,形态学观察和基因测序显示此3种野生菌与隐花青鹅膏在外形结构和基因序列上均有较高的相似性。用被鉴定为隐花青鹅膏的野生菌制作有机冷提浸膏,然后对HL-1细胞进行干预,发现不同地区的隐花青鹅膏浸膏可导致HL-1细胞不同程度的活性下降和凋亡率上升,对NUP155和HSP70蛋白进行检测发现部分实验组细胞中NUP155蛋白在被浸膏干预后表达量显著减少,并且偶见在胞质中散在表达,HSP70蛋白在HL-1细胞内的表达量可见显著上升,同时在细胞毒性较强、NUP155表达量下降较多的实验组中(如HQMG组)出现应激状态下HSP70在细胞质、细胞核内同时表达的现象。2.用隐花青鹅膏所制备干粉灌胃昆明小鼠,发https://www.selleck.cn/products/gw4869.html现除HQMG组、NJDA组外,小鼠血清心肌肌钙蛋白水平均呈一过性升高,多在7天左右达到峰值,然后降低,而HQMG组、NJDA组小鼠的血清心肌肌钙蛋白水平存在二次升高现象,在灌胃隐花青鹅膏14天后仍存在上升趋势。心电图检测发现小鼠在灌胃隐花青鹅膏后可出现房室传导阻滞、窦房阻滞等心律失常表现,与对照组比较分析后发现小鼠心电图改变以P波振幅降低最为明显。取小鼠心脏称量并计算脏器指数,未发现显著的变化,但在小鼠心肌的HE染色切片中发现存在疏松水肿、炎细胞浸润等病理改变,并且透射电镜可以观察到实验组小鼠心肌线粒体存在较为明显的水肿变性情况。3.我们通过观察绿色荧光标记蛋白、嘌呤霉素筛选及目的基因表达蛋白的检测确定成功构建了NUP155~(V402M)突变型与NUP155~(WT)野生型HL-1细胞株模型,然后用YNSUD发生地采集的隐花青鹅膏浸膏对其进行干预,结果显示突变细胞、野生型细胞及未转染HL-1细胞的细胞活性均显著下降,凋亡率显著上升,同时与野生型细胞相比,隐花青鹅膏浸膏干预后NUP155~(V402M)突变型细胞的凋亡率更高。免疫荧光和蛋白免疫印迹实验发现NUP155~(V402M)突变型HL-1细胞在被浸膏干预后NUP155蛋白普遍于胞质中表达,HSP70蛋白表达量显著升高且在细胞质中广泛表达。在被隐花青鹅膏干预后,HL-1细胞的HSP70蛋白在细胞质内表达的情况可见于未转染的HL-1细胞及NUP155~(V402M)突变型细胞,此现象在NUP155~(V402M)突变型细胞中更为明显。【结论】YNSUD发生地采集的隐花青鹅膏对HL-1心肌细胞及昆明小鼠心肌组织均存在毒性,且不同产地的隐花青鹅膏存在毒性差异。隐花青鹅膏干预可导致心肌细胞活性下降,凋亡率增高,导致心肌组织发生炎性细胞浸润和以房室传导阻滞为主的心律失常,其中机制与隐花青鹅膏干预后NUP155蛋白表达量下降,进而导致HSP70蛋白进入细胞核受阻,难以行使分子伴侣功能相关。在NUP155~(V402M)突变型背景下,隐花青鹅膏浸膏导致的NUP155蛋白功能变化更为显著,进而造成HSP70蛋白在应激状态下入核阻滞现象更为明显,对心肌细胞的损伤可更为严重。鉴于此,认为食用隐花青鹅膏可导致心肌损伤和心肌功能异常,且在食用者存在NUP155~(V402M)突变的情况下上述症状存在加重现象,故建议禁止食用隐花青鹅膏。