背景:脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是严重的中枢神经系统(central nervous system,CNS)创伤性疾病~([1])。中国SCI的年发病率约为37/100万,给个人和社会带来了沉重的医疗和经济负担~([2])。然而遗憾的是,由于SCI病理机制的复杂性和CNS神经元的不可再生性,SCI的临床治疗缺乏理想的方法。因此,探寻创新有效的 SCI治疗方案仍然是神经科学的重大任务,需要对SCI的病理机制进行深入研究。神经元死亡是SCI后神经功能障碍的直接原因,除了原发性损伤之外,炎症反应、缺血缺氧等也是影响神经元存活的继发性因素~([1])。铁死亡是一种程序性细胞死亡(programmed cell death,PCD),以铁离子过载和活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的积聚诱导细胞发生脂质过氧化为主要特征~([3])。细胞铁死亡参与多种疾病。根据现有研究提示,SCI后组织大量出血、溶血导致损伤局部出现铁离子超载,诱发神经细胞发生铁死亡;同时应激反应激活大量ROS的产生,使用铁死亡抑制剂去铁胺等可抑制铁死亡,从而促进SCI后功能恢复~([4])。小胶质细胞介导的促炎性反应参与脊髓继发性损伤,其中损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns,DAMPs)与Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)结合~([5]),启动TLRs/髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88,My D88)信号级联。铁死亡发生常常伴随小胶质细胞的促炎性激活,然而小胶质细胞在SCI后神经元铁死亡过程中发挥的作用及其分子机制尚不清楚。因此,探索小胶质细胞My D88信号对SCI后神经元铁死亡的调控作用及其可能的分子机制,可更好地认识SCI继发性损伤机制,并可为新的SCI治疗策略和靶点提供研究依据。研究目的:本研究旨在通过小鼠SCI模型和细胞培养实验的研究,阐明小胶质细胞My D88信号对神经元铁死亡发生发展中的调控作用及分子机制,以探寻挽救SCI过程中神经元铁死亡的新靶点。1、建立小鼠SCI模型探讨SCI后神经元铁死亡与小胶质细胞促炎性激活之间的关系。2、通过体内外实验探索促炎性激活的小胶质细胞在神经元铁死亡中发挥的作用与调控机制。研究方法:1、使用小鼠脊髓夹伤模型作为SCI的在体研究模型,使用神经元细胞系SH-SY5Y和小鼠原代神经元氧糖剥夺/复氧模型(oxygen and glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)作为离体实验研究模型。2、BMS(Basso Mouse Scale)评分和步态分析评估小鼠SCI后运动功能恢复情况。3、苏木精伊红染色(hematoxylin eosin,HE)检测小鼠SCI后损伤中心空洞大小。4、通过测定组织铁浓度和谷胱甘肽(Glutathione,GSH)含量反映脊髓组织铁积累和抗氧化水平。5、通过蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)及免疫荧光染色实验观察组织和细胞各相关蛋白分子的表达改变情况。6、通过共培养小胶质细胞和神经元细胞观察两者间的互作关系。7、碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色结合流式细胞术观察神经元细胞死亡率。8、CCK8(Cell Counting Kit-8)法检测神经元细胞活力改变情况。9、通过丙二醛(malondialdehyde,MDA)、4-羟基壬烯醛(4-hydroxynonenal,4HNE)水平检测神经元内脂质过氧化情况。10、通过BODIPY C11 581/591荧光探针检测神经元内Lipid ROS产生情况。11、用透射电镜观察脊髓神经元细胞内线粒体形态。12、通过荧光探针JC-1检测神经元细胞内线粒体膜电位改变情况。13、引入My D88~(f/f);TMEM119-Cre/ERT转基因小鼠,观察特异性敲除小胶质细胞My D88对SCI后神经元铁死亡的影响。14、用荧光原位分子杂交显示条件敲除小鼠脊髓的My D88 m RNA分布。研究结果:第一部分神经元铁死亡和小胶质细胞My D88信号激活同时出现于脊髓损伤区域用野生型(wild type,WT)小鼠建立SCI模型后,检测组织铁浓度及还原型GSH水平,发现SCI后三天组织铁含量显著升高,还原型GSH明显下降。此外,免疫荧光染色结果显示邻近损伤中心的神经元长链脂酰辅酶A合成酶4(acyl-Co A synthetase long-chain family member 4,ACSL4)表达显示增多。通过SCI小鼠的脊髓免疫荧光染色,我们发现发生脂质过氧化的神经元旁有明显活化的小胶质细胞。Western Blot结INCB018424 IC50果显示,SCI后铁死亡信号激活,同时My D88/NF-κB信号通路显著激活。第二部分促炎性激活的小胶质细胞My D88上调促进神经元铁死亡CCK8法检测细胞活力结果显示,OGD/R处理使SH-SY5Y细胞活力降低;而使用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激的小胶质细胞条件培养基(conditional medium,CM)可以在OGD/R基础上进一步显著降低SH-SY5Y细胞活力。PI染色后进行流式分析结果同样表明,在OGD/R处理的基础上,LPS刺激过的小胶质细胞CM可以进一步提高SH-SY5Y细胞死亡率。相一致的,Western Blot检测表明,CM培养的SH-SY5Y细胞中铁死亡分子谷胱甘肽过氧化酶4(glutathione peroxidase4,GPX4)的蛋白水平显著下降。另外,被LPS刺激后,促炎性激活的小胶质细胞My D88、NF-κB p65、i NOS表达显著升高;而在My D88抑制剂ST2825作用下,LPS刺激的小胶质细胞促炎性激活被显著抑制,而且这selleckchem Erastin种小胶质细胞的CM不会进一步加剧OGD/R的SH-SY5Y细胞活力下降和死亡率升高。相似的,用Transwell将OGD/R处理的神经元与LPS处理的小胶质细胞共培养后,神经元细胞活力进一步下降,死亡率进一步升高。ST2825可以明显抑制小胶质细胞因LPS刺激而升高的My D88/NF-κB表达及诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,i NOS)和细胞因子IL-1β的表达;将其与OGD/R处理的神经元共培养后,神经元细胞活力下降和死亡率升高的现象有所改善。细胞免疫荧光染色显示,共培养的神经元细胞Lipid ROS的表达显著降低,提示神经元脂质过氧化被抑制。检测神经元的丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量进一步证明,小胶质细胞My D88信号上调促进共培养的神经元脂质过氧化。Western Blot证明,抑制小胶质细胞My D88表达后,共培养的神经元铁死亡信号被明显抑制。荧光染色检测神经元线粒体膜电位JC-1证明促炎性活化的小胶质细胞进一步损伤神经元线粒体。第三部分小胶质细胞特异性My D88缺失抑制SCI后神经元铁死亡,并促进运动功能恢复他莫昔芬灌胃诱导TMEM119-Cre ERT;My D88~(flox/flox)转基因小鼠小胶质细胞中My D88的特异性敲除(My D88 CKO),通过荧光原位分子杂交和Western Blot证明特异性敲除小胶质细胞My D88的转基因小鼠构建成功。用该小鼠建立SCI模型比对照小鼠更早出现后肢站立、运动功能恢复更快且更好;HE染色也证明My D88 CKO小鼠SCI后脊髓组织损伤空洞较My D88 f/f小鼠的空洞更小。透射电镜结果证明,My D88 CKO小鼠SCI急性期损伤周边神经元异常线粒体较少,线粒体缩小程度下降。组织Western Blot检测进一步证实,My D88 CKO SCI小鼠SCI较同窝对照组脊髓My D88/NF-κB通路明显抑制,同时铁死亡信号通路同样明显减弱,损伤中心附近神经元immune-checkpoint inhibitor脂质过氧化减轻,与还原型GSH的检测结果也相一致。第四部分小胶质细胞My D88信号参与脊髓损伤后神经元铁死亡的潜在机制在小胶质细胞与OGD/R处理的神经元共培养体系中,Western Blot与细胞免疫荧光染色表明,LPS刺激使小胶质细胞中的铁调素(hepcidin)表达升高,而与LPS激活的小胶质细胞共培养的神经元铁转出蛋白(ferroportin,FPN)表达在OGD/R基础上显著下降,转铁蛋白受体(transferrin receptor,Tf R)显著升高。但是当小胶质细胞My D88受到抑制时,hepcidin的表达也显著下降,同时,神经元下降的FPN和升高的Tf R也被逆转。脊髓组织Western Blot结果同样显示,SCI后My D88 f/f组和My D88 CKO组hepcidin都明显上调,然而,与My D88 f/f SCI组相比,My D88 CKO SCI组脊髓hepcidin表达受到明显抑制。相应的,在My D88 f/f小鼠中,SCI后表现为FPN的下降和Tf R的升高。但在My D88 CKO SCI小鼠中,与My D88 f/f小鼠相比,FPN的和Tf R的改变同样被显著逆转。结论:SCI急性期神经元发生铁死亡,伴随邻近的小胶质细胞活化和My D88信号通路激活的结果提示SCI引起的小胶质细胞活化与神经元铁死亡之间的密切关系。细胞培养实验证明了小胶质细胞促炎性活化能促进神经元在OGD/R基础上进一步发生铁死亡。抑制小胶质细胞My D88表达可以明显抑制神经元铁死亡发生,证明小胶质细胞介导的My D88信号在神经元铁死亡中发挥关键作用。TMEM119-Cre ERT;My D88~(flox/flox)转基因小鼠特异性敲除小胶质细胞My D88能够显著下调SCI急性期神经元铁死亡基因,明显促进SCI后运动功能恢复,从而用在体实验证明了小胶质细胞My D88信号的上调在SCI后促进脊髓神经元铁死亡,而下调小胶质细胞My D88信号可减轻神经元铁死亡。小胶质细胞My D88信号与神经元铁死亡的互作主要由IL-1β/hepcidin/FPN轴调控。本研究为SCI中神经元铁死亡的调控机制提供了新的认识,可望为未来治疗SCI提供新的思路和靶点。