白粉病是由白粉菌引发的主要真菌病害之一,严重危害小麦、大麦等作物的产量和质量。目前,利用抗病基因来培育抗病品种是最经济有效的防治措施。到目前为止,小麦中已经命名了69个抗白粉病基因位点(Pm1-Pm69),其中Pm21是来源于簇毛麦的抗白粉病基因,编码典型的CC-NBS-LRR类型的抗病蛋白,在生产上表现出优异的广谱小麦白粉病抗性。来源于簇毛麦品系W619414的Pm21-B1,是Pm21的优异等位基因,和Pm21一样编码CC-NBS-LRR类型的抗病蛋白。本实验室前期的研究发现,过表达Pm21-B1的小麦和大麦转基因系对所有检测的小麦白粉菌小种和大麦白粉菌小种均表现为广谱抗病。本研究通过农杆菌介导的本生烟瞬时表达系统和大麦原生质体瞬时表达体系,系统地对Pm21-B1诱导细胞死亡的主要结构域和关键氨基酸开展了功能研究。利用瞬时表达系统在本生烟和大麦原生质体中表达不同长度的蛋白发现,Pm21-B1的CC结构域以及CC-NBS片段能够引发强烈的细胞死亡,而单独的NBS和LRR结构域及全长蛋白不能诱导细胞死更多亡,表Compound 3分子量明CC结构域是Pm21-B1诱导细胞死亡活性的必要结构域。进一步通过截短片段表达实验确定了1-139位氨基酸是Pm21-B1诱导细胞死亡功能的最短片段。将139位的I替换成E使得Pm21-B1~(1-139)、Pm21-B1 CC、Pm21-B1 CC-NBS以及自激活突变体Pm21-B1~(D491V)丧失了诱导细胞死亡的活性,表明第139位的异亮氨酸在Pm21-B1诱导细胞死亡活性中具有重要作用。此外,通过酵母双杂交实验检测不同结构域之间的互作情况,发现CC结构域可以形成同源聚合体,而将第139位的异亮氨酸突变后导致CC结构域之间不能相互作用,推测Ile13allergy immunotherapy9位点对细胞死亡活性的影响可能与Pm21-B1 CC结构域的分子间互作有关。显微镜观察发现野生型的Pm21-B1和诱导细胞死亡的自激活突变体Pm21-B1~(D491V)均定位于细胞质和细胞核中。通过在Pm21-B1~(D491V)的C端连接核定位信号(nuclear localization sequence,NLS)或核输出信号(nuclear export sequence,NES)改变Pm21-B1~(D491V)融合蛋白在细胞内的分布,发现仅定位于细胞质或细胞核内的Pm21-B1~(D491V)均不能诱导细胞死亡,不同亚细胞定位是否影响Pm21-B1抗病功能还需要进一步验证。这些结果表明,Pm21-B1~(D491V)引发的细胞死亡可能需要细胞核和细胞质中不同信号组分一起发挥作用。